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玉米是我国第一大粮食作物,作为工业原料、农业饲料、口粮和种子在国民经济的发展中占据举足轻重的地位。但我国人口众多,农村劳动力极度紧缺,随着饲料消费和玉米深加工消费的增长,愈发显现出我国人均玉米占有量低,刚性需求却越来越大的矛盾。不育系制种是世界范围内广泛采用的提高玉米杂交种产量的重要手段。人们在研究雄性不育机理的过程中逐渐加深了对植物生殖发育分子机理的研究,使得利用基因工程创造雄性不育系为作物育种开辟了一条崭新的道路。美国先锋公司发明的玉米SPT （Seed Production Technology）制种技术实现了核不育系的保持,不育系与保持系一系两用,能够方便有效区分可育株与不育株,选种时利用种子颜色差异可满足全程机械操作,繁殖时只需隔离自交,杂交F1代皆为非转基因种子,它使大规模安全利用杂种优势成为可能。本课题组经空间诱变获得稳定核不育系Sicau-ms,为使其能更快的应用于核不育系育种,实现核不育系的保持,本研究借鉴SPT制种技术的成功经验,利用重叠PCR和酶切连接相结合的方法构建出可以使花粉败育的淀粉酶基因花粉特异表达载体,通过农杆菌介导法将淀粉酶基因花粉特异表达载体转化优良自交系18-599R的愈伤组织。研究结果如下：1.利用高保真酶KOD Fx,以B73叶片总DNA为模板扩增花粉特异表达启动子Pg（X66692）,造粉体信号肽bt1（NM001112419）和苯磺胺代替物基因的终止子In2-1（NM001111963）,以18-599R萌发种子的cDNA为模板扩增α-淀粉酶基因（NM001156806）。通过目的片段回收测序,经NCBI进行序列比对,序列相似性分别为99%,100%,100%和95%。2.利用降落重叠PCR （TD-SOE-PCR）方法将4个目的片段按启动子Pg、信号肽bt1、α-淀粉酶基因、终止子In2-1的次序进行连接。设计具有反向互补末端的引物,分别以含4个目的片段的质粒为模板,用高保真酶KOD Fx扩增出具有反向互补粘性末端的目的片段,且在启动子Pg的5’端和终止子In2-1的3’端分别引入酶切位点HindⅢ和EcoR Ⅰ。采用降落重叠PCR （TD-SOE-PCR）的方法使具有互补链的各个片段通过重叠链的延伸拼接起来。将拼接后的淀粉酶基因表达盒连入零背景载体pEASY-B-Z后转化大肠杆菌,挑取单克隆进行菌液扩繁,提取质粒送往公司测序,经NCBI序列比对证实连接产物连接顺序正确无误,且序列相似性达99%。3.将淀粉酶基因表达盒成功连入植物表达载体CPB。用内切酶HindⅢ和EcoRⅠ酶切连入了淀粉酶基因表达盒的零背景载体质粒,回收淀粉酶基因表达盒。并用HindⅡI和EcoRⅠ酶切表达载体CPB的质粒,获得线性化载体。利用T4 DNA连接酶将二者进行连接。成功连接后将淀粉酶基因特异表达载体进行大肠杆菌的转化,涂于抗kana的平板上,12-16h后挑取单克隆进行扩繁,提取质粒,用EcoRⅠ和Hind Ⅲ 37℃酶切过夜后进行琼脂糖凝胶电泳,并以原始的CPB质粒为阴性对照,以淀粉酶基因表达盒序列为阳性对照,鉴定所提单克隆质粒为阳性克隆。4.以玉米优良自交系18-599R胚性愈伤组织为受体,通过农杆菌介导法转化目的表达载体。经不同浓度basta（1.5mg/L、2.5mg/L和3mg/L）进行3轮筛选后获得抗性愈伤分化成苗植株数为17株。以再生植株的基因组DNA为模板,抗除草剂bar基因和淀粉酶基因盒的特异性序列引物进行PCR,皆未扩增出目的条带,所得再生植株皆为假阳性苗,初步证实目的载体T-DNA区未整合到受体玉米自交系18-599R的基因组中。