卵运铁蛋白是鸡蛋蛋清中的四大过敏原之一,它可诱导机体发生Ⅰ型超敏反应,严重威胁鸡蛋过敏人群的身体健康。目前,鸡蛋卵运铁蛋白的研究主要集中于功能特性方面,关于它的消化稳定性、致敏性仅仅局限于其结构,忽视了机体对致敏性的作用。肠道致敏是食物过敏主要方式之一,而且过敏原耐胃肠消化和形成较大片段是它致敏肠道的先决条件。另外,通过消化稳定性预测致敏性评估是基于完整蛋白在一定时间内是否发生降解,尚未考虑消化残留片段及其致敏性。因此,本研究旨在结合卵运铁蛋白的消化稳定性与消化产物的致敏性,科学评估卵运铁蛋白的致敏性,有助于进一步理解卵运铁蛋白的致敏过程,提高我们对卵运铁蛋白过敏原的科学认知水平。本文以鸡蛋蛋清为原料,经酸沉淀预处理、柱层析制备获得高纯度的卵运铁蛋白,然后进行体外模拟婴幼儿和成年人胃液、小肠液及小肠刷状缘膜酶的消化,并通过Tricine-SDS-PAGE、RP-HPLC和MALDI-TOF-MS表征卵运铁蛋白消化产物片段,旨在阐明模拟消化液对卵运铁蛋白消化稳定性的影响。然后,通过ELISA检测消化产物的特异性IgE、IgG结合能力,并基于Caco-2细胞单层模型,评价卵运铁蛋白及其消化产物跨膜转运后的IgE结合能力。最后,利用KU812细胞脱颗粒模型评估消化产物的致敏性。研究的主要方法、结果及结论如下:在体外模拟婴幼儿消化模型中,大多数卵运铁蛋白可在模拟胃液中被消化,主要生成45 KDa左右的较大分子量蛋白,以及部分3-12 KDa产物;经过模拟小肠液消化后,卵运铁蛋白基本酶解完全,Tricine-SDS-PAGE中仅表现出一条极微弱条带,但3-12KDa的片段无明显变化;进一步经过BBM酶消化,卵运铁蛋白全部降解成小分子肽段,且大部分3-12 KDa片段又进一步被降解成更小的片段,消化产物组分增多,卵运铁蛋白被消化的更彻底,但仍保留有3 KDa以上的片段。在体外模拟成人消化模型中,卵运铁蛋白在模拟胃液可被全部降解,生成55 KDa、35 KDa左右的大分子蛋白和10 KDa以下的较小分子量蛋白;进一步经过模拟小肠液消化后,55 KDa、35 KDa两个大分子蛋白完全被消化,10 KDa以下片段继续降解;最后经过BBM酶消化,Tricine-SDS-PAGE中基本无条带,卵运铁蛋白全部被消化成3 KDa以下的片段。实验结果提示,成年人模拟消化液对卵运铁蛋白的消化能力比婴幼儿强。采用间接ELISA法测定卵运铁蛋白消化产物的IgG和IgE结合能力,结果显示,经体外模拟婴幼儿胃、胃-小肠、胃-小肠-BBM酶的消化,卵运铁蛋白消化产物的特异性IgG结合能力分别降低51.14%、66.80%、77.0%,特异性IgE结合能力分别降低34.21%、62.31%、68.22%;经体外模拟成人胃、胃-小肠、胃-小肠-BBM酶的消化,其特异性IgG结合能力则分别降低75.32%、89.20%、93.26%,特异性IgE结合能力分别降低57.27%、77.81%、84.59%。实验结果提示,随着消化过程的进行,卵运铁蛋白及其消化产物的潜在致敏性均逐渐降低。另外,比较同一消化阶段中婴幼儿和成年人的消化产物,后者致敏性更低。通过Caco-2细胞单层模型,模拟鸡蛋卵运铁蛋白消化产物在小肠中的跨膜转运情况,鸡蛋卵运铁蛋白成人胃肠消化产物在小肠跨膜转运模型中的表观渗透系数Papp>1×10^-5 cm/s,具有良好的吸收特征。在2 h内,经体外模拟婴幼儿胃、胃-小肠、胃-小肠-BBM酶的消化,卵运铁蛋白消化产物通过Caco-2细胞单层跨膜转运率分别为5.31%、6.56%、8.39%;与原蛋白相比,转运产物的特异性IgE结合能力分别降低45.59%、69.31%、84.06%。而模拟成人各阶段消化,消化产物跨膜转运率则分别为6.77%、9.32%、9.78%,转运产物的特异性IgE结合能力分别降低61.64%、78.43%、86.62%。结果表明:随着消化过程的进行,卵运铁蛋白消化产物的跨膜转运率逐渐升高、跨膜产物的IgE结合能力逐渐降低;比较同消化阶段中婴幼儿和成年人的消化产物,后者跨膜转运率更高且IgE结合能力更弱。通过测定嗜碱性粒细胞KU812活化脱颗粒释放的相关细胞因子含量,评价卵运铁蛋白消化产物的致敏性。卵运铁蛋白及其经胃、胃-小肠、胃-小肠-BBM酶的消化产物诱导细胞释放的β-氨基己糖苷酶、组胺、TNF-α、IL-4、IL-6、INF-γ含量分别为19.09%、14.06%、10.95%、8.31%;665.13 ng/m L、446.62 ng/m L、374.24 ng/m L、359.67 ng/m L;15.07 pg/m L、8.96 pg/m L、2.90 pg/m L、2.07 pg/m L;5.97 pg/m L、2.04 pg/m L、0.95 pg/m L、0.82 pg/m L;155.92 pg/m L、155.53 pg/m L、154.43 pg/m L、139.08 pg/m L;1.29 pg/m L、4.63 pg/m L、9.83 pg/m L、10.25 pg/m L。当模拟成人相应的各阶段消化时,卵运铁蛋白消化产物诱导细胞释放的β-氨基己糖苷酶、组胺、TNF-α、IL-4、IL-6、INF-γ含量则分别为13.95%、7.31%、5.65%;373.70 ng/m L、230.05 ng/m L、224.62 ng/m L;4.29 pg/m L、0.73 pg/m L、0.51 pg/m L;1.81 pg/m L、1.13 pg/m L、0.64 pg/m L;140.07 pg/m L、129.88 pg/m L、127.00 pg/m L;3.58 pg/m L、12.96 pg/m L、13.17 pg/m L。结果显示,随着消化过程的进行,卵运铁蛋白及其消化产物的脱颗粒能力逐渐降低,提示其潜在致敏性逐渐降低。另外,比较同消化阶段中婴幼儿和成年人的消化产物,后者脱颗粒能力更弱。总之,卵运铁蛋白具有一定的抗消化能力,在模拟婴幼儿消化液中比成年人消化液中更稳定。消化后的卵运铁蛋白仍具有较强的潜在致敏性,而且模拟婴幼儿消化产物致敏性更强,提示卵运铁蛋白更容易导致婴幼儿过敏。