背景:肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)大约占肝癌的75%,是一种病死率很高的恶性肿瘤。虽然针对肝细胞癌的治疗方法较多,但根治性的治疗手段仍旧是手术切除和肝移植。目前,HCC患者术后的高复发率和死亡率是导致患者术后五年总生存率偏低(仅为18%)的重要原因。要提高HCC的治疗效果,除了医疗诊治技术手段的不断提升,了解该疾病的发生发展机制并找出合适的干预治疗靶点亦十分重要。同时,肝癌的众多生物学功能中,肿瘤细胞不受控制地增殖是肝细胞癌进展的重要原因之一。综上,研究HCC增殖过程中的关键分子机制有望为该疾病的治疗提供新的理论基础及治疗策略。目的:本课题旨在研究HJURP分子促进肝细胞癌增殖的分子机制,并在肝癌细胞系和临床大样本中验证该分子的表达水平并探究其临床意义。首先,从体外构建HJURP稳定敲低及过表达的细胞模型,其次,在体外和体内水平上验证该分子能够调控肝癌细胞增殖的生物学功能,最终,深入阐明HJURP抑制p21表达的具体信号通路及分子机制。材料与方法:1、从浙江大学医学院附属第一医院肝胆胰外科收集219对肝癌及匹配的癌旁组织标本,从医院病历系统中统计相关的临床病理信息,利用实时荧光定量PCR、免疫组织化学的方法检测HJURP分子在HCC组织及癌旁组织的表达水平,分析HJURP与临床病理特征及HCC患者预后的相关性;2、从Oncomine数据库中提取HJURP分子在肝癌及癌旁组织中的表达数据,进行统计分析;3、通过慢病毒转染对肝癌细胞系HCC-LM3,Huh7进行转染,构建稳定敲低细胞株,用MHCC-97H细胞构建HJURP过表达细胞株,运用CCK-8、流式细胞周期检测、克隆形成及裸鼠皮下成瘤实验来验证HJURP促进肝细胞癌增殖的生物学功能,并用western免疫印迹实验检测细胞周期G1期相关的关键蛋白;4、在HJURP稳定转染的细胞模型中,运用western免疫印迹、免疫荧光验证HJURP调控抑癌分子p21的核浆穿梭,利用蛋白质免疫共沉淀技术检测p21的泛素化水平,并用免疫组织化学的方法在组织标本中证实HJURP与p21的表达呈负相关;5、在HJURP稳定转染的肝癌细胞株中,运用western免疫印迹实验通过信号通路的抑制剂及激活剂验证HJURP通过抑制MAPK/ERK1/2和激活AKT/GSK3β信号通路从而调控p21的出核及泛素化降解;6、通过功能回复实验证实HJURP促进p21泛素化降解的关键E3泛素化连接酶为SKP2。结果:1、在219对肝癌临床标本中,免疫组织化学及实时定量荧光PCR的结果证实HJURP在肿瘤组织中的表达水平显著高于癌旁组织,且74.54%的肿瘤组织中HJURP呈现高表达趋势。同时,western免疫印迹的结果提示,在6种常见的肝癌细胞系中,HJURP的表达也比正常肝细胞系高;2、体外和体内实验表明,HJURP敲低明显降低肝癌细胞的CCK-8吸光度和克隆形成、裸鼠皮下成瘤的能力,且引起肝癌细胞的G1期阻滞。在过表达HJURP后,肝癌细胞的增殖能力明显增强;3、HJURP促进p21蛋白从细胞核穿梭至细胞浆。同时,HJURP抑制p21发生在翻译后水平上。蛋白质免疫共沉淀的结果证实,HJURP促进p21的泛素化降解,主要是被E3泛素化连接酶SKP2降解;4、HJURP敲低之后,p21主要表达在细胞核内,且p-ERK1/2与p-GSK3β的表达增加,p-AKT的表达降低,HJURP过表达之后,p-ERK1/2与p-GSK3β的表达降低。此外,敲低HJURP之后加入ERK1/2通路抑制剂U0126和AKT通路激动剂SC-79后,p-ERK1/2与p-GSK3β的表达得到回复,且肝癌细胞的增殖能力也能够得到一定程度的回复;5、肝癌临床标本中的免疫组织化学的结果表明,HJURP高表达的标本中有69.5%呈现p21低表达,同时HJURP低表达的标本中有66.7%的标本呈现p21高表达;6、通过对临床标本对应的临床病理数据进行分析,结果提示HJURP高表达患者的总体生存率明显低于HJURP低表达者,且HJURP的高表达与肿瘤的大小及肿瘤的AJCC分期有相关性。结论:1、HJURP在肝癌组织中呈明显高表达,且与肝细胞癌的增殖功能及HCC患者的不良预后相关;2、敲低及过表达HJURP可以分别显著降低和增加肝细胞癌的增殖功能,且HJURP促进p21从细胞核穿梭至胞浆,并被SKP2泛素化降解;3、MAPK/ERK1/2和AKT/GSK3β信号通路参与HJURP抑制p21表达的生物学过程,是HJURP促进肝细胞癌增殖的潜在分子机制。