研究已证明氧化应激与胚胎发育不良有着密切联系,骨骼系统的发育是胚胎发育的一个重要环节,然而关于氧化应激与胚胎骨骼发育的关系研究还报道尚少。在前期研究中我们发现高剂量自由基诱导剂诱导的氧化应激会导致胚胎肢芽发育畸形,本文将进一步深入探讨氧化应激对胚胎骨生成的影响与作用机制。首先,我们给予鸡胚不同浓度的AAPH(0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0μmol/egg)建立氧化应激鸡胚模型。给予AAPH处理后,鸡胚孵育至12.5天,测定相关指标,确定建立慢性氧化应激鸡胚模型的最佳剂量。结果显示,鸡胚的死亡率和畸形率随着AAPH浓度的增加而增加,AAPH对鸡胚的半数致死剂量为4.8μmol/egg。不同浓度的AAPH(0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0μmol/egg)均能造成鸡胚氧化应激,例如骨骺软骨细胞ROS生成速率增高,线粒体膜电位降低。我们确定0.5μmol/egg的AAPH作为建立慢性氧化应激鸡胚模型的剂量,在此剂量下鸡胚长骨长度较正常组相比显著性缩短。其次,我们以AAPH(0.5μmol/egg)建立的氧化应激鸡胚模型为基础,探讨氧化应激对胚胎软骨内成骨的影响,为此依次进行了以下实验:(1)连续取16.5、17.5、18.5天鸡胚长骨进行阿利新蓝&茜素红双染,测量胫骨和股骨长度,检测氧化应激对鸡胚长骨生长速度的影响。结果显示,AAPH诱导的氧化应激能显著性减缓鸡胚长骨的生长速度,缩短长骨长度。(2)连续取16.5、17.5、18.5天鸡胚长骨进行石蜡切片,H&E染色处理,分别测量其胫骨、股骨骨骺端软骨细胞增殖区和软骨细胞膨大区的长度,检测氧化应激对鸡胚长骨软骨内成骨的两个关键步骤—软骨细胞增殖和软骨细胞膨大的影响。结果显示,氧化应激显著性缩短了鸡胚长骨骨骺端软骨细胞增殖区和膨大区的长度,导致鸡胚长骨软骨细胞增殖速度减慢,软骨细胞膨大骨化速度降低。同时还发现鸡胚长骨骨骺软骨增殖区软骨细胞总数减少,正处于分裂期的细胞数下降。(3)采用Micro-CT术检测鸡胚发育后期长骨的相关骨指标,验证氧化应激导致的胚胎骨发育不良。结果显示,氧化应激显著性降低了鸡胚长骨的骨量和骨密度,导致胚胎不良的骨生成。(4)采用RT-PCR术检测软骨内成骨的关键调控因子Sox9和Runx2以及相关基因Type II collagen和Aggrecan的基因表达。结果显示,氧化应激显著性降低了这些基因的表达水平。综上所述,AAPH(0.5μmol/egg)诱导的慢性氧化应激会导致胚胎长骨Sox9的表达下降,从而下调了Type II collagen和Aggrecan的表达,影响了软骨细胞的生存、营养和代谢,抑制了软骨细胞的增殖,减缓了长骨的生长发育速度。AAPH氧化应激诱导的Sox9蛋白量表达下降,会直接导致预膨大软骨细胞中磷酸化Sox9蛋白的减少,导致预膨大软骨细胞直接进入终末分化阶段,发生凋亡,大大减少了成熟膨大软骨细胞的数量,造成Runx2表达的降低,导致长骨的骨化不良、骨量和骨密度降低。本研究结果阐明了氧化应激对胚胎骨生成的影响,并初步揭示了具有临床代表性的胚胎慢性氧化应激对骨骼发育的影响机制,该研究结果对预防和治疗氧化应激对胚胎发育的影响、提高胚胎发育质量有着重要意义。