[目的]小脑浦肯野细胞（Purkinje cell,PC）主要从起源于广泛脑区的苔藓纤维（Mossy fiber,MF）-颗粒细胞（Granule cell,GrC）-平行纤维（Parallel fibre,PF）途径和起源于延髓下橄榄核（Inferior olivary nuclus,IO）神经元的攀爬纤维（Climbing fibre,CF）途径获得来自外部的兴奋性信息。促肾上腺皮质激素释放因子（Corticotropin-releasing factor,CRF）作为应激反应主要激素,可通过CF分泌释放到小脑皮层,通过CRF受体在小脑神经环路突触传递与长时程可塑性中发挥重要的调节作用。CRF受体隶属G蛋白偶联型受体,包括CRF受体1（CRF receptor 1,CRF-R1）和受体2（CRF receptor 2,CRF-R2）,在小脑中均有表达。前期研究发现CRF主要通过CRF-R1调节PC的简单峰电位（Simple spike,SS）和复杂峰电位（Complex spikes,CSs）放电活动、调制分子层中间神经元（Molecular layer interneuron,MLI）-PC突触传递,然而CRF-R2受体对小鼠小脑皮层PF-PC和CF-PC突触传递及其长时程可塑性的作用机制还不十分清楚。因此,本研究采用在体细胞贴附式记录、离体全细胞记录、免疫荧光共染技术和神经药理学方法,研究CRF-R2在面部喷气刺激诱发的小鼠小脑皮质PF-PC突触传递中的作用机制,探讨CRF-R2对CF-PC突触传递及突触可塑性的影响,旨在阐明CRF-R2在小脑皮层PC信息传递及长时程可塑性中的作用机制。[方法]1.在体实验C57BL/6雄性小鼠（6-8周龄）,使用乌拉坦（1.3 g/kg体重）腹腔注射麻醉后,在小脑脚II（Crus II）或蚓部（vermis）VI-VII区,开约为1-1.5 mm的孔,暴露小脑表面,并用蠕动泵将含氧的人工脑脊液（Artificial cerebrospinal fluid,ACSF）持续灌流到手术暴露的部位。在体电生理实验采用PC贴附式记录方式,记录电极进入脑组织的大约深度为160μm到210μm之间,以出现自发性SS和CSs来判定是否是PC,记录其自发性SS和CSs活动以及感觉刺激引起的电活动。感觉刺激为对同侧触须垫的喷气刺激,喷气系统由定量喷射仪（Picospritzer）、Master 8和计算机组成。每次记录一幕的持续时间为25秒,刺激间隔设置为30秒。所有药品溶于ACSF中,采用脑表面灌流给药,通过在ACSF中加入γ-氨基丁酸受体A（γ-amino butyric acid,GABAA）阻断剂,分离出兴奋性谷氨酸能突触传递。2.离体实验小鼠经异氟脘吸入麻醉后,小脑切成250μm厚的矢状切片。全细胞记录PC的电活动,电极内液中添加生物素,实验结束后使用福尔马林对脑片进行固定,后续开展生物素染色。为记录CF-PC突触传递,我们在颗粒层（Granular layer,GL）放置一个刺激电极,电刺激CF诱发PC产生突触后电流反应,测试刺激为间隔50毫秒的配对脉冲,脉冲波宽为0.2毫秒,该刺激可在PC诱发产生一对兴奋性突触后电流（Excitatory postsynaptic current,EPSCs）,N1和N2,并计算N2/N1振幅比值。在CF-PC长时程突触可塑性实验中,诱导前用测试刺激记录10分钟的稳定反应,诱导刺激模式为5赫兹,持续30秒的连续刺激,诱导刺激结束后持续记录50分钟。此外,应用同龄小鼠进行CRF-R2的免疫组织化学染色,明确其在小脑皮层的分布情况。[结果]第一部分:CRF-R2在小鼠小脑皮层PF-PC突触传递中的作用机制（1）在体小脑皮层PC的贴附式记录结果显示,小脑表面灌流选择性CRF-R2激动剂,尿皮质素Ⅲ（UrocortinⅢ,UCNⅢ）明显增加SS的放电频率和瞬时频率,但显著降低峰峰间隔（Interspike interval,ISI）。灌流CRF-R2受体阻断剂,antisauvagine-30不影响SS放电频率,却消除了UCNⅢ对PC放电活动的影响。（2）对小鼠同侧触须垫的喷气刺激引起小脑皮层Crus II区产生抑制性突触后电位,抑制PC放电活动,出现一定时间的放电暂停（pause）。在GABAA受体阻断剂存在下,感觉刺激诱导PC产生简单峰电位（Evoked simple spike,e SS）放电,表明阻断中间神经元的抑制性传入后,感觉刺激诱发PF-PC突触的兴奋性反应。（3）在UCNⅢ存在情况下,感觉刺激引起的e SS放电数目明显增加,这种增加作用能够被CRF-R2阻断剂antisauvagine-30消除。UCNⅢ对感觉刺激反应的增强作用可以被蛋白激酶A（Protein kinase A,PKA）抑制剂H-89和KT5720阻断,也可以被腺苷酸环化酶（Adenylate cyclase,AC）抑制剂SQ22536阻断,但不能被蛋白激酶C（Protein kinase C,PKC）抑制剂chelerythrine阻断,表明活化CRF-R2通过AC-PKA途径上调感觉刺激诱发的PF-PC突触传递。第二部分:CRF-R2在小鼠小脑皮层CF-PC突触传递中的作用机制（1）在麻醉小鼠小脑表面灌流UCNⅢ能够明显增强自发性CSs放电活动,导致CSs小穗数量增加、放电暂停时间增长,这种增强作用可被CRF-R2拮抗剂,antisauvagine-30完全阻断。（2）在CRF-R1拮抗剂,BMS-763534存在下,CRF明显增加CSs的小穗数目和暂停时间,CRF对CSs活动的增强作用可被CRF-R2拮抗剂,antisauvagine-30完全阻断。（3）在离体条件下,用配对电刺激CF在PC产生兴奋性突触后电流N1和N2,UCNⅢ显著增加CF-PC突触传递,表现出N1的振幅明显增加,同时N2/N1比值（Paired-pulse ratio,PPR）明显的减小,表明UCNⅢ通过突触前作用增强CF-PC突触传递,给予antisauvagine-30不影响N1的振幅和PPR,却完全消除了UCNⅢ对CF-PC突触传递的增强作用。（4）灌流CRF-R1阻断剂,BMS-763534没有对N1的振幅和PPR产生影响,但是在BMS-763534存在下,灌流CRF可引起N1振幅增加、PPR降低,这种变化可被CRF-R2拮抗剂阻断。（5）灌流PKA抑制剂KT 5720可消除UCNⅢ引起的N1增强作用,但电极内液中添加膜非通透性PKA阻断剂PKI 14-22却不能阻断UCNⅢ引起的N1增强作用,表明UCNⅢ增强CF-PC突触传递发生在突触前而非突触后。（6）小脑皮层CRF-R2荧光免疫染色结果显示,小脑皮层PC和分子层（Molecular layer,ML）有丰富的CRF-R2分布。第三部分:CRF-R2在小鼠小脑皮层CF-PC长时程可塑性中的作用机制（1）给予CF频率为5赫兹,持续30秒的电刺激,可引起N1的振幅长时间明显降低,但不伴有PPR的明显改变,表明该频率的强直刺激可以诱导小鼠小脑皮层CF-PC产生突触后长时程抑制（Long-term depression,LTD）。（2）在UCNⅢ存在下,给予CF频率为5赫兹,持续30秒的电刺激,不能诱导CF-PC LTD。但在阻断CRF-R2条件下,该刺激可诱导CF-PC LTD,但不改变PPR,表明强直刺激诱导的小鼠小脑皮质CF-PC突触后LTD被CRF-R2的激活所阻断。（3）阻断代谢型谷氨酸受体1（Metabotropic glutamate receptors1,m Glu R1）的活性,5赫兹,30秒的CF电刺激没有改变N1的振幅和PPR。然而,m Glu R1阻断剂和UCNⅢ共同存在下,5赫兹,30秒CF强直刺激使N1的振幅增大,并伴有PPR的降低,表明阻断m Glu R1依赖的CF-PC LTD,活化CRF-R2可以激发CF-PC产生突触前长时程增强（Long-term potentiation,LTP）。（4）当电极内液用PKI 14-22抑制突触后PKA时,强直刺激CF不会改变N1和PPR的振幅,但灌注UCNⅢ,强直刺激增加了N1的振幅,并降低了PPR,表明活化CRF-R2激发了CF-PC LTP,该LTP不依赖于突触后PKA信号通路。然而,活化CRF-R2所激发的CF-PC LTP可以被灌流PKA抑制剂KT5720所消除,在KT5720和UCNⅢ同时存在时强直刺激CF不会改变N1振幅和PPR,表明活化CRF-R2激发的CF-PC LTP依赖于突触前PKA信号通路。[结论]（1）在小鼠小脑皮层感觉信息传递过程中,活化CRF-R2能够通过AC-PKA信号通路,而不是PKC信号通路易化PF-PC的感觉信息传递,使小脑皮层对传入的感觉信息的敏感性增强。（2）激活小鼠小脑皮层CRF-R2后通过突触前而不是突触后PKA信号通路增强CF-PC突触传递,增强IO的信息在小脑皮层的传递。（3）活化CRF-R2可以消除突触后PKA介导的CF-PC LTD,其作用机制可能与活化CRF-R2激发突触前PKA介导的CF-PC LTP有关。