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目的:探讨电针“水沟穴”对TBI后意识障碍大鼠意识水平和皮层脑电的影响,并研究电针“水沟穴”对TBI后意识障碍大鼠Orexin-1(OX1)及其受体Orexin-1-Receptor(OX1R)的影响,从电生理和分子生物方面探索电针促醒的机制。方法:实验一电针“水沟穴”对TBI后意识障碍大鼠意识水平及皮层脑电的影响SD大鼠26只,雄性,10%水合氯醛麻醉后,埋置皮层电极,深度以触及硬脑膜为度;大鼠恢复1-2周后采用SPSS软件生成随机序列将植入电极后恢复正常的大鼠随机分为:假手术组、TBI组、电针组和拮抗剂组;采用控制性皮层撞击法建立TBI大鼠模型,造模后1小时后根据大鼠的感觉和运动功能划分其意识水平,选择符合意识障碍水平的大鼠进行记录;意识状态评估后电针组电针“水沟穴”15min,拮抗剂组腹腔注射拮抗剂OXR(SB334867,30mg/kg),注射完后即刻进行电针;电针结束后持续采集脑电24小时;将脑电数据导入Neuro Explorer分析6、12、24小时三个时间点各段ECoG中δ、θ、α、β波频段构成比,采用SPSS 23.0对数据进行分析。实验二电针“水沟穴”对TBI后意识障碍大鼠OX1及受体OX1R的影响选用成年SD大鼠144只,采用SPSS软件生成随机序列随机分为:假手术组TBI组、电针组、拮抗剂组;采用控制性皮层撞击法建立TBI大鼠模型,造模后1小时后根据大鼠的感觉和运动功能划分其意识水平,意识状态评估后电针组电针“水沟穴”15min,拮抗剂组腹腔注射拮抗剂OX1R(SB334867,30mg/kg),注射完后即刻进行电针;分别于治疗结束后6、12、24小时三个时间段分批取材,一部分取组织冻存用于检测外侧下丘脑OX1含量和内侧前额叶OX1R表达;另一部分灌注后包埋,最后进行免疫组化实验,以观察外侧下丘脑Orexin神经元情况和mPFC区OX1R表达。结果:1.实验一电针“水沟穴”对TBI后意识障碍大鼠意识水平及皮层脑电的影响(1)电针“水沟穴”可以缩短TBI大鼠意识障碍时间(P<0.05),注射拮抗剂后,电针促醒效应被抑制;(2)电针“水沟穴”对TBI大鼠ECoG的影响:①低频段(δ、θ、δ+θ)δ波:左侧6、24小时电针组、假手术组δ波低于拮抗剂组和TBI组(P<0.05),拮抗剂组δ波占比高于TBI组(P<0.05);12小时假手术组δ波占比均低于拮抗剂组和TBI组(P<0.05),拮抗剂组δ波占比高于TBI组(P<0.05);右侧:6、12小时电针组、假手术组δ波低于拮抗剂组和TBI组(P<0.05),电针组δ波占比高于假手术组(P<0.05);24小时:拮抗剂组和TBI组δ波高于假手术组(P<0.05),电针组δ波占比高于假手术组、低于拮抗剂组(P<0.05);假手术组左、右侧脑电各时间点均无差异,TBI组、电针组、拮抗剂组左侧δ波占比均低于右侧(P<0.05)。θ波:各组个时间点组内、组间比较无统计学差异;假手术组12、24小时右侧θ波占比均高于左侧(P<0.05);TBI组、拮抗剂组左、右侧脑电个时间点均无差异,电针组24小时右侧脑电θ波占比高于左侧(P<0.05)。δ+θ:左侧6小时拮抗剂组、TBI组δ+θ波占比高于假手术组(P<0.05),电针组δ+θ波占比低于拮抗剂组(P<0.05);12小时拮抗剂组δ+θ波占比高于TBI组、电针组、假手术组(P<0.05);24小时:拮抗剂组δ+θ波高于电针组、假手术组(P<0.05);右侧6小时拮抗剂组、TBI组δ+θ波均高于电针组、假手术组(P<0.05),电针组δ+θ波占比高于假手术组(P<0.05);12小时拮抗剂组和TBI组δ+θ波高于假手术组(P<0.05);24小时:假手术组δ+θ波占比与拮抗剂组、TBI组、电针组有差异(P<0.05)。假手术组6、24小时左侧δ+θ波占比低于右侧(P<0.05);TBI组、电针组、拮抗剂组各时间点左侧δ+θ波占均低于右侧(P<0.05)。②高频段(α、β、α+β)α:左侧6小时假手术组α波占比高于TBI组、拮抗剂组(P<0.05),12、24小时拮抗剂组α波占比低于假手术组(P<0.05),右侧各时间点组间α波占比变化无差异(P>0.05);左、右两侧组内α波占比变化无差异(P>0.05);假手术组、TBI组、电针组在6、12、24小时点左侧脑电α波占比高于右侧(P<0.05);拮抗剂组6、12小时点左侧脑电α波占比高于右侧(P<0.05);β:左侧6小时假手术组β波占比高于TBI组、拮抗剂组(P<0.05),12、24小时,假手术组β波占比高于拮抗剂组(P<0.05),右侧6、12小时假手术组、电针组β波占比高于TBI组、拮抗剂组(P<0.05);24小时假手术组β波高于拮抗剂组(P<0.05);各组组内比较无差异;假手术组、拮抗剂组12、24小时左侧β波占比高于右侧(P<0.05);TBI组各时间点左侧β波占比高于均右侧(P<0.05);电针组6、24小时左侧β波占比高于右侧(P<0.05)。α+β:左侧6小时假手术组α+β波占比高于TBI组、拮抗剂组(P<0.05),电针组α+β波占比高于拮抗剂组(P<0.05),12小时假手术组、电针组α+β波占比高于拮抗剂组(P<0.05);24小时拮抗剂组α+β波低于电针组、TBI组及假手术组(P<0.05),右侧6、24小时假手术组α+β波占比与TBI组、拮抗剂组、电针组有差异(P<0.05),6小时电针组α+β波占比高于TBI组(P<0.05);12小时假手术组α+β波占比高于TBI组、拮抗剂组(P<0.05),电针组α+β波占比高于拮抗剂组(P<0.05)。2.实验二“水沟穴”对TBI大鼠OX1及受体OXIR的影响(1)电针“水沟穴”对TBI大鼠LHA区Orexin阳性神经元的影响组间比较:24小时假手术组、电针组阳性神经元计数均高于TBI组、拮抗剂组(P<0.05);组内比较:TBI组12小时Orexin神经元计数高于6小时(P<0.05),拮抗剂组12时Orexin神经元计数高于6、24小时(P<0.05)。(2)电针“水沟穴”对TBI大鼠LHA区OX1的影响组间比较6小时TBI组、拮抗剂组低于假手术组(P<0.05),12、24小时TBI组、拮抗剂组低于假手术组、电针组(P<0.05);组内比较:TBI组24小时OX1浓度低于12小时(P<0.05)。(3)电针“水沟穴”对TBI大鼠mPFC区OX1R蛋白WB表达的影响组间比较:各组外侧下丘脑Orexin-1的表达水平在6h、12h、24h三个时间点均呈现为“拮抗剂组、TBI组、空白、电针组”依次递增趋势,6小时假手术组、电针组均高于TBI组(P<0.05);12小时假手术组、电针组高于TBI组、拮抗剂组(P<0.05);24小时假手术组高于TBI组、拮抗剂组,电针组高于拮抗剂组(P<0.05);组内比较无差异。(4)电针“水沟穴”对TBI大鼠mPFC区OX1R蛋白免疫组化表达的影响组间比较:6小时拮抗剂组OX1R表达量较假手术组、电针组降低(P<0.05);12小时TBI组OX1R表达量低于假手术组、拮抗剂组低于假手术组、电针组组;24小时假手术组、电针组OX1R表达量高于TBI组、拮抗剂组,电针组低于假手术组(P<0.05),组内比较无差异。结论:1.电针“水沟穴”可以有效改善TBI大鼠意识水平,缩短昏迷时间,促进觉醒;2.电针“水沟穴”可以降低TBI大鼠ECoG功率谱中低频频段(δ波、θ波)占比,增加高频波频(α、β)占比,改善丘脑—皮层网络功能连接,提高大脑皮层神经元的兴奋性;3.注射OX1R受体拮抗剂后,一定程度上可以抑制电针“水沟穴”的促醒作用,提示Orexin可能通过其受体OX1R参与电针“水沟穴”对意识障碍的调节;4.电针“水沟穴”可以减少TBI大鼠外侧下丘脑的Orexin丢失,上调外侧下丘脑OX1及mPFC区OX1R表达,注射OX1R受体拮抗剂后,电针“水沟穴”上调OX1作用被抑制,提示Orexin是调节电针“水沟穴”促醒作用的重要神经递质。