碳青霉烯耐药肠杆菌科细菌（Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae,CRE）近年来在国内外的分离率呈逐渐上升的趋势,据文献报道,已在与人类密切相关的动物、环境、果蔬中检测到产碳青霉烯酶细菌;作为碳青霉烯酶的一种主要类型,新德里金属β-内酰胺酶（NDM）能够赋予菌株几乎所有的β-内酰胺抗性,已有24种NDM变异体被发现,NDM阳性大肠杆菌已在全球范围内出现并广泛传播。本研究旨在了解江苏境内生猪养殖场、猪屠宰生产加工过程及环境中bla NDM耐药基因的分布及丰度,分析bla NDM阳性大肠杆菌耐药情况,并在此基础上揭示NDM阳性大肠杆菌的分子流行病学特征。试验一、江苏地区bla NDM阳性大肠杆菌的流行病学本研究自2018-2019年选取江苏境内定点猪屠宰场和南通、常州、泰州、淮安、盐城共5个地方的养殖场,共采集肛拭子、表面擦拭样、盲肠内容物样品及环境样品831份,在46份样品中检测到NDM耐药基因（5.54%）;在生猪养殖场的肛拭子样品（4.12%）、屠宰场的盲肠内容物（26.67%）及放血后、开膛前的猪表面擦拭样（8.84%）中检测到了bla NDM耐药基因,在屠宰场其余的表面擦拭样及环境样品中均未检测到NDM耐药基因。分离bla NDM阳性菌株包括160株大肠杆菌,7株变形杆菌,4株假单胞菌,9株威斯康星米勒菌,3株莫甘尼菌。对bla NDM阳性大肠杆菌进行了13种超广谱β-内酰胺酶类基因（ESBL）的检测,发现携带5种优势ESBL类基因,分别是bla TEM,bla SHV,bla CTX-M-9,bla OXA-2,bla OXA-10。挑选不同样品来源、含有不同的ST型及含有多个ESBL类基因的NDM阳性的45株bla NDM阳性大肠杆菌按照CLSI标准使用二倍稀释法进行最小抑菌浓度（MIC）的测定,结果发现NDM阳性的大肠杆菌对头孢类药物（头孢噻呋、头孢他啶）、四环素、氨苄西林都呈现100%耐药,对美罗培南耐药率为55.56%（25/45）,对亚胺培南耐药率相对于美罗培南高17.33%;实验结果还表明了NDM-5阳性的大肠杆菌对美罗培南的最小抑菌浓度≥8μg/m L,普遍高于NDM-1（MIC≤4μg/m L）,提示NDM-5的活性高于NDM-1,可诱导菌株更强的耐药能力。45株NDM阳性大肠杆菌除对替加环素敏感外,对氨基酸糖苷类药物、喹诺酮类药物都呈现出不同水平的耐药。试验二、江苏地区bla NDM阳性大肠杆菌的分子特征对分离的160株bla NDM阳性大肠杆菌进行多位点序列分型（MLST）,共包括15种ST型,ST410,ST48,ST10,ST206和ST846为优势ST型,ST3076,ST4214和ST1626三种ST型为本研究首次发现。这些菌株通常携带ESBL类基因,而且在人医临床与兽医中广泛报道。挑选15株含有不同NDM变异体、ESBL类基因及ST型的NDM阳性大肠杆菌（菌株编号为JSEwj-31-JSEwj-45）,XbaⅠ酶消化后,通过脉冲场凝胶电泳（Pulsed-field Gel Electrophoresis,PFGE）进行分子分型分析。根据PFGE聚类结果,15株大肠杆菌可以分为11个PFGE型别,菌株呈现多样化。同一样品的分离株倾向于相同的PFGE型别,在小范围内存在相同的PFGE图谱;不同的ST型间具有相同的PFGE图谱;同一种ST型具有不同的PFGE图谱。MLST和PFGE虽均属于细菌分型的技术,PFGE是利用限制性内切酶切割特异性位点,然后通过变化的电场将大小不同的片段分开,一般用于短期内暴发性的分析。MLST是通过扩增7个管家基因,通过测序然后与数据库进行比对确定不同的ST型,7个管家基因相对保守,变异频率较低,故一般用于跨度时间较长,范围较大的流行病学调查。根据本研究,江苏地区ST846和ST206都同时出现了B类和H类的PFGE图谱,而ST206型和ST846型的菌株又存在不同的PFGE图谱,这是江苏地区猪源bla NDM阳性大肠杆菌流行的分子特征。试验三、NDM耐药基因的定位与遗传环境分析对细菌编号为JSEwj-31-JSEwj-45共15株NDM阳性的大肠杆菌进行接合转移实验,结果显示15株菌的bla NDM基因都具有可转移性,接合转移频率范围是5.38×10-07-2.2×10-02。对膜结合转移试验中获得结合子进行S1-PFGE未能对NDM耐药基因进行定位。选取膜结合转移中的结合子具有不同的质粒图谱类型的供体菌,通过电转化试验获得6株菌的电转结合子,对结合子进行NDM耐药基因的定位,S1-PFGE结果显示4株大肠杆菌bla NDM基因都定位在质粒上,质粒类型大小总共包括两种,一种大小在～54kb-～76kb中间,另一种大小在～40kb左右。对JSEwj-31-JSEwj-45进行二代重测序,结果发现（1）bla NDM阳性大肠杆菌携带37种抗性基因,这些抗性基因赋予菌株对β-内酰胺类,氨基糖苷类,氟喹诺酮类,多粘菌素,大环内酯类,四环素类,利胆醇,磺胺类,甲氧苄啶和磷霉素等12种药物的抗性,并出现9种β-内酰胺酶类耐药基因。（2）NDM耐药基因定位于三种不同的基因环境,其中约91.67%（11/12）的bla NDM-1主要定位于I型基因环境,bla NDM-5（1/1）主要定位于II型基因环境。I型基因环境结构全长为9401bp,bla NDM-1所在基因区域的4318bp与Klebsiella pneumoniae plasmid p Kp ANDM-1（Gen Bank:FN396876.1）基因有100%相似性,此类基因环境较为普遍;II型基因环境结构有一个2180bp携带bla NDM的基因片段与III型基因结构相应的片段相似性≥99.9%。综上所述,本研究发现bla NDM耐药基因主要存在于上游的生猪养殖场及运输环境,并随猪体传播转移至屠宰场,大多数bla NDM耐药基因定位在质粒上,并可发生结合转移。江苏地区bla NDM阳性大肠杆菌携带5种ESBL类基因,多重耐药现象较为严重,菌株呈现多样化的分子特征,本研究为猪源碳青霉烯耐药菌的全面监测及风险评估提供科学依据。