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深度烧伤常常导致患者发生增生性瘢痕,临床表现为色红、突出和质硬。往往给患者身心带来严重伤害。增生性瘢痕的发病机制已成为烧伤修复领域研究的重点。我们在前期研究中选用含4096个人类基因的表达谱芯片对5例增生性瘢痕患者及自身正常皮肤进行差异表达基因的筛选,发现其中一个基因P311引人注目,它在烧伤病人早期增生性瘢痕组织中表达显著增高[1-2]。P311蛋白不属于任何一种已知蛋白家族,对其功能少有研究。Pan等发现P311基因可以诱导TGF-β1非依赖的肌成纤维细胞表型样改变[3]。Fujitani等证实腺病毒介导的P311基因上调可以促进大鼠面神经损伤侧轴突再生[4]。为进一步探讨P311基因在增生性瘢痕中的潜在分子机制,我们利用酵母双杂交系统,以融合Gal4 DNA结合域的P311为诱饵蛋白,筛选了成人肝cDNA文库,获得了与P311相互作用的候选蛋白HT036[5]。HT036基因做为一功能未知新基因,其序列由Xu等在2001年首次提交基因库,编码一胞内蛋白。为探讨HT036基因在增生性瘢痕形成中的可能机制,我们首先检测了该基因在增生性瘢痕和同体正常皮肤中的表达差异,随后观察了HT036基因在成纤维细胞转分化中的作用,最后在原核表达系统中表达该蛋白,为后续研究做准备。研究内容和方法一、HT036基因在增生性瘢痕和同体正常皮肤中表达差异。样本经PBS清洗,提取组织总RNA,通过RT-PCR试剂盒检测HT036mRNA表达量,为保证RT-PCR在线性范围,扩增选取30个循环。采用β-actin为内对照,并用软件Quantity One分析表达量。二、HT036和P311在成纤维细胞转分化中的作用研究。通过PCR获得人HT036编码基因,经EcoRⅠ和SaLⅠ双酶切,克隆至真核表达载体pEGFP-N2,经酶切和测序鉴定正确。人胚肺成纤维细胞株(MRC-5)购自美国ATCC,采用含10%小牛血清、100U/ml青霉素G、100ug/ml链霉素DMEM培养。采用LipofectamineTM2000转染MRC-5细胞,48小时提取细胞总蛋白,通过Western blot检测α-SMA和内参GAPDH,并用软件Quantity One分析表达量。采用同样的方法转染293细胞,收集72小时培养上清,用ELISA检测纤维化相关指标TGF-β1,MMP-2,MMP-9。三、HT036蛋白原核表达、鉴定和诱导动力学研究我们按前述方法构建原核表达载体pET30a(+)-HT036,经酶切和测序鉴定正确后,重组载体转化至大肠杆菌DE3(BL21)pLysS菌株。通过IPTG诱导蛋白表达,并用特异性His抗体鉴定,并且对IPTG最佳诱导时间和诱导浓度进行分析。研究结果一、HT036基因在增生性瘢痕和同体正常皮肤中表达差异。3例患者的HT036表达在增生性瘢痕组织中都降低,与同体正常皮肤相比,分别降低70%,75%和46%。二、HT036和P311在成纤维细胞转分化中的作用研究。HT036抑制MRC-5细胞α-SMA表达,而P311诱导其表达。α-SMA相对表达量在空白组、HT036组、P311组和共转染组分别为0.13,0.03,0.18,0.05。HT036降低293细胞TGF-β1,MMP-2,MMP-9的分泌。与P311组相比,分别降低46.4%,33%和29%。三、HT036蛋白原核表达、鉴定和诱导动力学研究成功构建了原核表达载体pET30a(+)-HT036,并在大肠杆菌中成功表达。SDS-PAGE分析显示在29KDa分子量处出现强的蛋白带,达总蛋白的20%表左右。Western blot检测出单一的抗His阳性条带。最佳诱导时间为加入IPTG后4h,各IPTG诱导浓度间表达量无明显差别。研究结论一、增生性瘢痕组织中HT036表达降低。二、HT036能抑制成纤维细胞转分化。三、成功表达了HT036蛋白。