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毛蚶（Arca subcrenata Lischke）属于软体动物门瓣鳃纲列齿目蚶科毛蚶属,是一种双壳贝类海洋生物,药食两用。每年秋至次年春捕捞,洗净,去软体部分后干燥获得的外壳部分为中药“瓦楞子”的原料之一,具有软坚散结,消痰化瘀、制酸止痛等功效。常用于治疗顽痰胶结,黏稠难咯,瘿瘤,瘰疬,癍瘕痞块,胃痛泛酸等;软体部分具有补血、温中、健胃等功效,适量食用具有益血色,除烦醒酒,破结消痰等作用。有研究表明,毛蚶提取物具有抗肿瘤、增强免疫活性、抗氧化、抗菌以及降血脂等潜在药用价值。近年来研究发现,毛蚶提取物具有一定的广谱抗肿瘤活性,课题组前期从毛蚶提取物中得到的具有体外抗肿瘤活性的毛蚶抗癌活性蛋白并对其抗癌机制进行了初步研究,目前有关毛蚶提取物的抗肿瘤活性研究主要集中于上皮来源的癌细胞,对于造血系统（骨髓）异常引发的恶性肿瘤细胞的抑制作用及机制尚未见深入研究。实验目的:考察毛蚶抗癌活性蛋白（Arca subcrenata Lischke anticancer protein,ASAP）在体外对人慢性粒细胞性白血病K-562细胞的细胞毒作用及其机制,进一步分离ASAP。实验方法:ASAP由毛蚶软体经常规低温水提及硫酸铵沉淀法制备;考马斯亮蓝G-250（Bradford）法测定ASAP蛋白浓度并计算蛋白含量;Tricine-SDS-PAGE法确定ASAP分子量范围;倒置相差显微镜下观察ASAP作用后K-562细胞形态学变化,Giemsa染色观察细胞及核的变化;MTT法考察ASAP对K-562细胞生长的影响及其细胞毒作用随作用浓度和时间的变动情况;Annexin-V/PI双染色法配合流式细胞术检测细胞凋亡;PI染色法配合流式细胞术检测周期变化情况;Western blotting考察细胞凋亡及周期相关蛋白procaspase-3、caspase-3,Pdcd4以及p53的表达情况。利用FPLC系统结合Superdex200凝胶柱层析法对ASAP进行活性成分分离、纯化。实验结果:真空冷冻干燥法结合Bradford法计算得出ASAP冻干粉中蛋白含量为（79.95±7.11）%;通过Tricine-SDS-PAGE结果可以看出,ASAP主要为分子量范围在30kDa以下的一种多组分蛋白混合物。MTT显示,在24-72h,ASAP对K-562细胞生长具有明显的抑制作用,细胞毒作用呈时间和剂量依赖性,24、48和72h的浓度-效应相关系数分别为 0.851（p<0.01）、0.8977（p<0.01）和 0.8997（p<0.01）。ASAP50、100、200、400和800μg·mL-1的时间-效应相关系数分别为0.0195（p<0.05）、0.7043（p<0.01）、0.9359（p<0.01）、0.9735（p<0.01）和 0.9698（p<0.01）。ASAP 对 K562 细胞 48h 的 IC50 为200μg·mL-1。镜下观察,浓度为200μg·mL-1的ASAP作用于K-562细胞48h,ASAP处理组K-562细胞出现变形或核碎裂等形态学变化;流式细胞术结合Giemsa染色显示,ASAP可引起K-562细胞凋亡及G2-M期阻滞,随着ASAP浓度的增加,细胞凋亡率明显增加,ASAP 200μg·mL-1处理48h组K-562细胞凋亡率为早期（32.75±0.07）%vs对照组的（3.7±1.13）%（p<0.01）,以及晚期（31.25±2.19）%vs 对照组的（9.9±0.85）%（p<0.01）;细胞周期检测结果显示,G2-M期细胞比例随着ASAP浓度的增加而明显增加,ASAP 200μg·mL-1处理48h组G2-M期细胞比例为（55.16±1.73）%,与对照组的（15.26±0.82）%相比显著增加（p<0.01）;Western blotting 结果显示,ASAP 作用0-40h内,细胞中凋亡蛋白caspase-3前体procaspase-3（35kDa）32h时呈现明显下调趋势（p<0.01）,同时可检测到凋亡蛋白caspase-3（17kDa）的表达明显增加（p<0.01）,而随着药物作用时间的延长,Pdcd4和p53蛋白表达均呈下调趋势（p<0.01）。ASAP中含量最高,分子量约为22kDa的组分,具有K-562细胞毒性,48h的IC50约为80μg·mL-1。结论:ASAP是一种分子量在30kDa以下的蛋白质混合物,对K-562细胞具有显著的细胞毒作用,诱导K-562细胞凋亡及G2-M期阻滞是ASAP细胞毒作用的主要机制;ASAP可以诱导K-562细胞发生caspase-3通路依赖的细胞凋亡,Pdcd4及p53蛋白表达下调与ASAP诱导K-562细胞凋亡及G2-M期阻滞相关。ASAP中含量最高且具有K-562细胞毒性的组分是分子量约为22kDa的组分。