论文部分内容阅读
背景：循环DNA （circulating DNA）是存在于血清、血浆、唾液、尿液、脑脊液、前列腺液等体液中游离于细胞外的DNA。由于循环DNA在肿瘤、心肌梗死以及胎儿产前诊断中有重要的诊断价值，对其检测亦有“液体活检”之称。但是，循环DNA本身是自然降解的，并且其检测是一个多步骤的过程，从标本采集直到检测分析，其中的每一步都可能对检测结果产生重要的影响。在本课题中，我们通过对分别位于16条常染色体和性染色体上共20个STR位点的分析，研究了不同温度条件下DNA在血清、尿液以及唾液中降解为77~446bp的小片段的半衰期情况，并且初步探讨了尿液对DNA的降解机制，从而，对体液标本采集后到提取前的放置时间、条件以及扩增子大小对检测结果的影响进行了初步的讨论。方法：于体液中分别加入“裸DNA”和DNA-蛋白质复合物，在室温和37°C条件下孵育一定时间，应用全自动核酸提取仪，采用磁珠法对降解的系列体液标本统一进行DNA提取，同时，采用法医学实验室亲子鉴定技术对所提取DNA的20个短串联重复序列（STR）位点进行扩增分析，探讨了不同体液中高分子量基因组DNA降解为77~446bp的小分子片段的半衰期情况。同时，我们通过在尿液中加入EDTA、将尿液高温高压处理以及配制与尿液中尿素浓度相当的尿素溶液的方法，研究尿液中的酶类、耐高温成分以及尿素对DNA降解的影响。结果：1. DNA在血清中降解动力学的测定结果“裸DNA”和DNA-蛋白质复合物在室温及37°C条件下符合一级动力学规律，相应的半衰期如下：在室温条件下，“裸DNA”和DNA-蛋白质复合物在血清中的降解半衰期分别为71.4min和346.5min；在37°C条件下，两种形式核酸的降解半衰期分别为26.8min和157.5min。2.唾液DNA降解动力学测定结果在室温和37°C条件唾液DNA降解符合一级动力学规律，相应的半衰期分别为253.2min和172.9min。3.尿液对DNA的降解作用结果尿液对DNA的降解作用极强，我们采用加入DNA降解一半时所对应的尿液稀释倍数来反映尿液对DNA的作用。发现，“裸DNA”在尿液中降解极快，其降解一半时所对应的尿液稀释倍数为6.9，而DNA-蛋白质复合物降解一半对应的稀释倍数为4.4。4.尿液中导致DNA降解成分的初步分析结果尿液中的耐热成分对DNA降解有着非常重要的作用，其次，尿素也对DNA降解有一定的作用，而EDTA可以部分抑制尿液对DNA的降解作用，结论：1.“裸DNA”和DNA-蛋白质复合物在血清中的降解符合一级动力学规律，在室温条件下降解半衰期约为1h和6h；而在37°C条件下的半衰期约为0.5h和2.5h。2.唾液DNA降解符合一级动力学规律，在室温和37°C条件下的半衰期约为4h和3h，同时，DNA-蛋白质复合物在血清中的降解情况与唾液DNA的降解也较为相似。3.与血清和唾液相比，尿液对DNA的降解作用最强。经过进一步观察发现，尿液对DNA的降解作用可能与其中的耐热和不耐热成分均有一定的关系。