研究背景及目的原发性肝癌(HCC)在我国癌症发生率中位列第四,居恶性肿瘤导致人类死亡的第二位。由于缺乏明确的早期诊断标志物、特异性的临床症状等,肝癌患者确诊时通常已是晚期,大多数患者失去了手术机会,总的5年生存期很短。因此,研究影响肝癌的诱发因素及侵袭和转移的过程,进而研发肝癌治疗药物是现在研究重点。任何人体细胞的诱导分化、成熟均依靠人体细胞增殖迁移与凋亡平衡的过程,一旦这种均衡被破坏后就会引起各种疾病的出现或恶性肿瘤的发生,特别是人体细胞的增殖程度和恶性肿瘤的诱发及其侵袭转移有直接关系。MicroRNA(miRNA)是一类高度保守的长度为21-25nt的单链内源性非编码RNA小分子片段,通过特异性序列转录翻译或mRNA分裂来指导基因的表达,进而参与人体细胞发生、诱导、增值和自然凋亡等过程。人类从世界上第一个miRNA出现之后,众多的miRNA被研究,目前已发现的成熟体miRNA已大于2500个,大概调控人体内部1/3以上的编码基因。人体原发性肝癌的诱发是由多个抑癌基因下调、原癌基因激活及一系列调控机制导致的复杂过程。由于编码基因转录水平的调控失衡,出现组织细胞异常克隆性增生诱导肝癌。在人体原发性肝癌的生长、发展进程期间,miRNA通过抑癌基因活性下调,诱导正常细胞向异常细胞转变,或将细胞分化降低和抑制凋亡基因进而使异常细胞无节制生长;有些miRNA也可起到抑癌基因作用,抑制原癌基因和转移增值相关基因等作用,进而起到抑制肝癌细胞增殖和迁移过程。同时,miRNA通过大量调控基因的表达而起到作用,进而使细胞活动的各个方面进行调控,主要在细胞迁移、增殖、凋亡等不同的的生理、病理过程。因此miRNA对于人体正常肝细胞的异常转变、侵袭及迁移等多种病理生理进程期间起着重要的地位。近期的研究发现,人类microRNA中有一半位于与癌症相关的位点,这些定位提示microRNA可能与肿瘤的发生有关。很多学者研究显示,多个microRNA与肿瘤的发生、病理分级、临床分期、肿瘤的耐药性及预后等相关,若干microRNA直接参与肿瘤(包括前列腺癌,胰腺癌,肺癌,结肠癌等)各种进展过程。而且miRNAs在人体内一部分可成为抑癌因子,一部分可成为促癌因子,这些双重作用引导大量研究者在这些层面进行基础性的探索。大量的资料显示,一类特殊的小RNA在HCC里面发生转录改变,进而导致肝癌出现异常的表达过程。近期研究表明有多个miRNAs在肝细胞癌中是高表达的,包括miR-181,miR-21,miR-324,miR-186,miR-155等。另外,有部分miRNAs在肝细胞癌中低表达的,它们分别是:miR-139,miR-198,miR-199a-3p,miR-199a-5p,miR-195,miR-34a等。MicroRNA-198是miRNAs家族的重要一分子。有资料显示miR-198在前列腺癌、结肠癌及胰腺癌、肺癌等肿瘤中是低表达或无表达的。但是在肝癌中的情况还不甚明确。因此,我们研究团队猜测可能miR-198在HCC的诱导及进展中有重要影响。结合以上文献资料,本课题对miR-198在不同的肝癌细胞株及肝癌组织进行检测,研究miR-198的表达水平与HCC病人的生存期关联;然后运用体内外实验对miR-198在肝癌Huh7细胞株的增殖和侵袭进行测定;最后运用Western Blot方法对miR-198运用生物信息学预测的靶基因ZEB2行进一步验证。本研究具体为以下三部分:第一部分miR-198在不同肝癌细胞株及肝癌组织的表达及与肝癌生存期关系方法1首先运用Real-time PCR测定肝癌不同细胞株和肝癌组织中MicroRNA-198的情况;2解析miR-198表达水平同肝癌患者临床资料及预后之间的关联。结果1与正常肝细胞chang liver和LO2相比,miR-198在肝癌细胞HepG2、Huh7、Hep3B和MHCC97H细胞中表达下调,其中Huh7细胞中表达最低;2 65例肝癌患者组织标本中,miR-198的表达水平在肿瘤分化程度(高、中、低)、TNM分期(ⅠⅡ、ⅢⅣ)、有无脉管癌栓、有无血管受侵、有无包膜受侵及有无远处转移等均有明显差异,且与对应的癌旁组织表达相比降低;miR-198表达水平与肝癌患者生存时间长短密切相关,呈正相关性。小结miR-198在HepG2、Huh7、Hep3B和MHCC97H细胞中的表达水平低下,且在临床HCC患者标本与其对应的癌旁正常肝组织对比,miR-198的表达水平也呈下降趋势;miR-198的表达水平与HCC患者不良预后临床参数负相关,且与患者的生存时间呈正相关,提示miR-198是肝癌患者一种负性调节因子,同患者生存期呈正相关性。第二部分探讨miR-198在肝癌Huh7细胞株中的生物学功能方法1在体外用miR-198模拟物(mimics)转染Huh7细胞;2运用流式细胞术检测miR-198对Huh7细胞凋亡影响;3通过CCK8实验、软琼脂克隆形成实验检测miR-198对Huh7细胞增殖能力的影响;4运用划痕实验、Transwell实验检测miR-198对Huh7细胞迁移功能影响;5体内裸鼠成瘤实验检测miR-198对Huh7细胞体内成瘤能力的影响。结果1流式细胞仪检测发现miR-198促进Huh7细胞凋亡;2 CCK8实验、软琼脂克隆形成实验与对照组比较,肝癌Huh7细胞株在转染miR-198 mimics显示,Huh7细胞株增殖情况显著降低;3划痕实验及Transwell实验都证实,miR-198能够抑制肝癌Huh7细胞株的迁移功能;4裸鼠动物体内实验结果显示:转染miR-198的Huh7细胞的成瘤功能显著受到下调。小结本阶段实验显示miR-198可以下调肝癌Huh7细胞株增殖迁移功能,增加Huh7细胞的凋亡比例;而且miR-198可以下调肝癌Huh7细胞株的增殖和成瘤功能,显示miR-198对肝癌细胞的增殖和迁移起到抑制功能。第三部分miR-198靶基因预测及初步功能鉴定方法1利用生物信息学的方法对miR-198的靶基因进行了初步预测;2双荧光素酶报告系统验证miR-198直接靶向的基因;3运用Real time PCR及Western Blot检测NC、转染miR-198后Huh7细胞中ZEB2的表达水平;4利用RNA干扰技术沉默ZEB2的表达,运用Transwell实验检测其对Huh7细胞迁移能力;5分析miR-198和ZEB2在肝癌组织中的表达相关性。结果1利用生物信息学的方法初步明确ZEB2为miR-198的靶基因;2通过双荧光素酶报告系统,我们发现miR-198可以显著降低含有ZEB23’UTR-WT序列的报告基因载体的荧光素酶相对活性,提示miR-198可以直接靶向ZEB2;3 Real time PCR及Western Blot示ZEB2在肝癌组织表达与对应的癌旁组织对比显著升高;转染miR-198组、siZEB2组后ZEB2的表达明显下降;4 Transwell实验结果示miR-198 mimics组及Si-ZEB2组的迁移细胞数显著减少;5 miR-198和ZEB2在肝癌组织中的表达呈负相关性。小结本部分实验结果表明,ZEB2是miR-198的目标基因,miR-198是借助调节靶基因ZEB2的表达,进而调控肝癌Huh7细胞株的增殖和迁移;miR-198可通过抑制ZEB2的表达,从而抑制了Huh7细胞的迁移功能。结论本研究结果表明miR-198在肝癌组织及肝癌细胞中的表达水平低下,且其表达高低与肝癌的发展作用密切,呈负性调节关系。而且通过双荧光素酶报告系统证实miR-198靶基因为ZEB2,通过抑制ZEB2的表达进而抑制HCC的增殖、迁移。miR-198有可能成为肝癌的新的生物标志物,为我国肝癌患者的诊断、预后提供新的治疗途径。