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黑暗链霉菌H6(Streptomyces tenebrarius H6)产生三种抗生素:安普霉素、氨甲酰妥布霉素和少量氨甲酰卡那霉素B。为研究妥布霉素生物合成基因簇中tacB基因的功能,利用PCR扩增获得tacB及其上下游部分序列,SalI酶切剔除了基因内部部分序列,构建基因阻断载体pHZ132-△tacB,经接合转移导入黑暗链霉菌H6中。首先筛选到红霉素抗性的单交换菌株,无药传代后,点种筛选到红霉素敏感的菌株,进一步利用PCR、测序筛选到双交换的tacB基因阻断株S.tenebrarius tacB-。经发酵产物分析,阻断变株合成一种新的抗生素组分。
通过离子交换的方法,提取阻断株所产生的新组分,MS、NMR分析确定该新组分为3’-脱氧-氨甲酰卡那霉素C。
为排除基因阻断导致的极性效应,对阻断株进行互补实验。完整的tacB基因由汞抗性基因启动子(PmerR)启动,构建基因互补质粒pSET152-tacB,经接合转移转化阻断株S.tenebrarius tacB-,筛选获得红霉素抗性转化子,发酵产物分析获得互补菌株 S.tenebrarius tacB--tacB。进一步产物提取,HPLC-ELSD分析确定互补菌株恢复产生了氨甲酰妥布霉素。
氨甲酰妥布霉素与3’-脱氧-氨甲酰卡那霉素C在结构上仅有的差别:前者为6’-氨基,而后者为6’-羟基。Blast分析推测TacB为脱氢酶,本实验最终证明了TacB为6’-脱氢酶,为阐明完整的妥布霉素生物合成途径奠定基础。