研究背景和目的慢性乙型肝炎是广泛在我国流行的一种疾病,由此引起肝脏慢性疾病在中国的发病率非常高,很大程度上损害了居民的生活质量和生命健康。其中,最严重也是特别引起人们重视的是肝细胞癌。随着根治性切除手术、肝移植及局部射频消融等技术的发展,肝细胞癌患者5年生存率已有了很大提高,但扩散转移及术后复发仍是制约预后的重要因素,所以全身药物的辅助治疗作用也逐渐凸显其价值,比如多靶向抗肿瘤药物索拉非尼在肝细胞癌临床实际治疗中的应用。苦参碱(MT)和氧化苦参碱(OMT)是临床中常见的两种来源自中草药的药物,他们是存在于中药材苦参中的主要生物碱,也是该味中药的主要药理成分,目前,除广泛应用于肠炎、妇科疾病外,在肝脏疾病方面已应用于抗肝炎、抗肝纤维化等治疗,临床研究和基础实验均发现,其具有治疗慢性肝炎,并预防肝脏纤维化发生等作用。同时,体外细胞及动物实验已经证实其对多种肿瘤疾病有一定的治疗作用,如肺癌,黑色素瘤,白血病,淋巴瘤,胃肠道癌,胰腺癌,肝细胞癌,胆囊癌等。在体外及动物实验中发现,二者可以采取调节肝细胞癌细胞内信号通路,调控细胞内相关蛋白转录表达水平的方式,发挥抑制肝癌细胞增殖、侵袭及转移,促进其凋亡等作用。但是,MT和OMT抗肿瘤的药理作用不强,所以为了提高药效,研究人员进行了结构设计和改造,得到了13-甲氨基-18-硫代苦参碱(M19),并以此为蓝本,经历多步骤的加成化合等反应,合成了WM-1系列苦参碱衍生物。前期研究已经发现,M19可以显著抑制小鼠巨噬细胞内Akt磷酸化的水平,在细胞和动物实验中初步发现其在预防肝纤维化发生等方面的效果比MT和OMT这两个原型明显,同时在也发现了它可能具有抑制肿瘤增殖的作用。表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR)是存在于胞膜上的一种分子量为170kD的跨膜糖蛋白,胞内成分具有酪氨酸激酶活性,是常见的几种生长因子配体的主要结合受体,包括EGF, HB-EGF, TGF-β等。EGFR表达升高或者活性增强通常对肿瘤的发生、恶性细胞的失控性增殖、肿瘤细胞分化不良等事件发生有促进作用。研究已发现多种恶性肿瘤组织中EGFR高表达或者活性增强,譬如乳腺癌,肺癌等等,多项研究对肝细胞癌行病理分析时也发现了其可高表达EGFR,而且人们发现它的表达量和肝细胞癌的临床分期和预后情况相关程度较高。EGFR可以通过对下游信号通路的调节,主要是MAPK/ERK信号通路,发挥调节细胞内基质金属蛋白酶(MMPs)的转录和表达的作用。现在,基质金属蛋白酶(MMPs)在多种恶性肿瘤发生转移和侵袭行为中的重要作用已经得到了一致认同,在众多MMPs中人们最关注的莫过于基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9),有报道在包括肺癌、乳腺癌、胃癌、肝癌等多种肿瘤实验模型和人体病理组织标本中发现二者表达水平升高。在肿瘤组织细胞中,细胞内合成的是MMPs的前体蛋白,所以分泌到细胞外后,MMPs还需要特定的酶原激活物质来将它激活,才会具有水解细胞外基质和协助肿瘤细胞穿透和转移的能力,所以机体可以通过调控转录表达水平和调节胞外MMPs活化两种手段来调节MMPs的功能。本研究拟通过体外细胞实验及动物实验,探寻新型苦参碱衍生物对肝细胞癌(HCC)细胞增殖和侵袭能力等细胞行为方面的影响,并通过研究其对肝癌细胞内相关信号通路及蛋白表达的影响,探讨该类型苦参碱衍生物抗肝细胞癌(HCC)的作用及其可能的分子机制。研究方法1.通过细胞增殖实验MTT方法筛选出WM-1系列苦参碱衍生物中对肝癌细胞作用较强及作用稳定者,在较敏感的细胞系中进行下一步实验；2.将不同浓度梯度苦参碱衍生物WM-108作用于不同肝癌细胞系,检测其抑制肝癌细胞增殖能力,及增殖抑制作用与浓度和时间的关系；3.Annexin V/PI双染色流式细胞术检测经苦参碱衍生物WM-108干预后,Hep3B细胞凋亡的变化情况；4.采用细胞划痕实验和Transwell侵袭实验检测WM-108的干预对侵袭和转移能力不同的两种肝癌细胞(LM3和Hep3B)侵袭转移能力的影响；5. Western blot和荧光定量RT-PCR方法检测各浓度WM-108作用下Hep3B细胞内与增殖和侵袭转移密切相关的蛋白转录和表达水平的变化；6.用明胶酶谱方法检测经干预后Hep3B分泌至细胞培养上清液中MMPs的活性变化；7.建立Hep3B皮下成瘤和肝脏原位裸鼠肝癌模型,并给予药物干预,观察WM-108对肿瘤的生长和裸鼠模型一般情况的影响,干预结束后取肿瘤标本行病理组织HE染色检测等病理检查。结果(一)苦参碱衍生物WM-108能明显的抑制肝细胞癌细胞的增殖能力1.WM-1系列苦参碱衍生物对人肝癌细胞系SMMC-7721、HepG2、Hep3B、 HCCC-9810等细胞增殖都具有一定的抑制作用,其中WM-108作用比较显著且稳定;2.苦参碱衍生物WM-108对Hep3B的增殖有抑制作用,且强于同浓度苦参碱衍生物,其24h半数抑制浓度(IC50)为127.3+18.49mg/L；3.在低浓度(150mg/L浓度)下,WM-108对人肝细胞系干预24h后未表现出显著的增殖抑制作用,药物浓度过高时(>150mg/L),可以表现出一定增殖抑制作用(约20%)；(二)苦参碱衍生物WM-108对肝癌细胞凋亡和迁移侵袭能力的影响1.给予一系列浓度梯度的WM-108干预后,明显地促进了Hep3B细胞凋亡率的升高,但随着药物浓度的增高,其导致细胞坏死的作用表现越明显,200mg/L时可导致约30%以上细胞坏死；2.WM-108在低浓度(10mg/L,20mg/L,30mg/L)就可表现出降低肝癌细胞系Hep3B和LM3迁移能力的作用；3. Transwell证实Hep3B和LM3在WM-108作用下穿透Transwell小室基质胶能力下降。(三)苦参碱衍生物WM108可以调节Hep3B细胞信号通路和相关蛋白表达,发挥抑制细胞增殖和侵袭能力的作用1.经苦参碱衍生物作用后,Hep3B细胞内EGFR磷酸化水平下降,其下游信号通路中的AKT和ERK磷酸化水平随之下降；2. RT-PCR和Western Blot方法证实药物干预后,Hep3B细胞内MMP-2和MMP-9转录和表达水平下降,且其抑制剂TIMP-1和TIMP-2表达量并未有明显的变化；3.明胶酶谱实验检测发现,在WM-108的作用下,肝细胞癌Hep3B培养24h后的细胞培养上清液中MMP-2和MMP-9的活性下降。(四)皮下和原位成瘤的肝癌裸鼠模型证实了苦参碱衍生物WM-108在活体动物模型中也表现出一定的抗肿瘤作用1.与对照组比较,WM-108在50mg/kg剂量下能延缓裸鼠皮下和肝脏原位肿瘤的生长速度,但抑瘤作用不如30mg/kg剂量下的5-氟尿嘧啶明显；2.WM-108腹腔注射对裸鼠模型一般情况影响比5-Fu小,特别是对体重影响与空白对照组无明显差别,5-Fu影响裸鼠模型体重明显；3.病理组织切片的HE染色发现,和对照组肝癌瘤体组织相比,使用WM-108后肝癌肿瘤组织中心坏死区域扩大,周围出现小的坏死灶,和5-Fu作用后肿瘤组织的病理表现类似。结论本课题在细胞和动物水平上研究了苦参碱衍生物WM-108对肝细胞癌的作用,并结合药物对细胞内相关信号通路传导和蛋白表达的影响研究讨论了其作用机制。实验发现,较之普通苦参碱,苦参碱衍生物WM-108具有明显抑制肝癌细胞增殖的能力,在合适的浓度下,药物还能促进细胞凋亡的发生,浓度过高时,其直接导致肿瘤细胞坏死的作用明显。WM-108药物能引起肝癌细胞Hep3B内EGFR磷酸化水平下降,进而导致下游与细胞增殖生存密切相关的信号通路中的某些蛋白(AKT和ERK)磷酸化水平降低,起到抑制细胞增殖和促进其凋亡的作用。WM-108还可引起肝癌细胞侵袭能力下降,其原理可能是药物下调下游信号通路PI3K/AKT, MAPK/ERK中相关蛋白磷酸化,导致基质金属蛋白酶2和9(MMP-2, MMP-9)表达下调,水解细胞外基质(ECM)功能降低。裸鼠皮下及肝脏原位成瘤肝癌模型在腹腔给予WM-108一定剂量和一定时间后(50mg/kg,5次,2天1次),与对照组相比能延缓肿瘤的生长,且对裸鼠体重等一般情况的影响比5-氟尿嘧啶小。