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心肌肥厚是心脏对外界刺激做出的适应性应答,前期工作已证明,myocardin能够促进心肌肥厚,激活胎儿基因ANF,BNP等的表达,激活肥厚的发生。神经元限制性沉默因子(NRSF)又称REST,能够抑制神经元基因和非神经元基因的表达。目前研究证实,NRSF能够抑制多个胎儿基因的表达,但是NRSF与myocardin的相互作用关系在心肌肥厚关系并未得到证实。本研究拟对NRSF与myocardin之间的对心肌肥厚的作用进行阐明。分别用血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)或内皮质素-1(ET-1)处理H9c2和原代大鼠心肌细胞48 h,利用实时荧光定量PCR,蛋白免疫印迹,细胞免疫荧光技术检测肥厚标志基因ANF,BNP,Sk-α-actin等的表达,证明AngⅡ和ET-1能够诱导心肌细胞发生肥厚。在心肌细胞肥厚过程中,利用实时荧光定量PCR,蛋白免疫印迹技术检测NRSF表达,结果发现NRSF表达下调。进一步发现用siRNA干扰NRSF的表达后,肥厚标记基因ANF,BNP,Sk-α-actin以及myocardin的表达出现上调。进一步探究NRSF调控心肌肥厚的分子机制,利用荧光素酶报告基因分析实验检测NRSF对myocardin的转录调控作用的影响,结果显示NRSF能够降低myocardin诱导的ANF,BNP,SK-α-actin的转录活性。利用慢病毒侵染技术,构建稳定转染NRSF的H9c2细胞系,实时荧光定量PCR,蛋白免疫印迹技术检测到过表达NRSF的心肌细胞低表达myocardin,并能抑制myocardin的转录。进一步利用免疫共沉淀技术检测证明NRSF与myocardin之间存在蛋白与蛋白相互作用。染色质共沉淀实验证明NRSF能够抑制myocardin与CArG box的结合。凝胶迁移实验进一步证明NRSF能够抑制myocardin与SRF/CArG的结合。本文实验阐明NRSF不仅能够抑制myocardin的表达,还能抑制myocardin与SRF/CArG box的结合。综上所述,本文主要研究证实NRSF可以通过抑制myocardin的转录和表达、抑制myocardin与CArG box的结合等机制抑制胎儿基因的表达,进而抑制心肌细胞肥厚。