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目的探讨肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system,RAS)激活对慢性肾病(chronic kidney disease,CKD)ApoE-/-小鼠炎症的影响及机制。方法一.动物实验1.用5/6肾切除法(subtotally nephrectomized,SNx)构建ApoE-/-小鼠CKD模型。2.将ApoE-/-小鼠分为对照组、SNx组和氯沙坦组,造模后第5周开始灌胃给予氯沙坦组小鼠30 mg/kg/d剂量的氯沙坦连续12周,其余小鼠给予等体积0.5%羧甲基纤维素钠.3.造模16周后,眼球取血,测血清尿素氮、肌酐和血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)水平。4.用HE染色法观察动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)斑块形态学改变。5.用免疫组化法检测主动脉根部AS斑块中巨噬细胞的含量,用CD68标记巨噬细胞;用流式细胞仪检测外周血中炎性单核细胞的比例;用实时荧光定量PCR检测主动脉中促炎因子IL-6、TNF-α和趋化因子MCP-1、CX3CL1的m RNA表达。6.用免疫组化法检测主动脉根部AS斑块中P-IRE1α蛋白的表达;用Western blot检测主动脉中GRP78蛋白表达和IRE1α磷酸化情况。二.体外实验1.用MTT法检测AngⅡ刺激的Raw264.7细胞增殖情况。2.用不同浓度及时间的AngⅡ刺激Raw264.7细胞,Western blot检测GRP78表达和IRE1α磷酸化。3.氯沙坦干预AngⅡ刺激的Raw264.7细胞后,用Western blot检测检测GRP78、P-IRE1α、P-IKKα/β、IκB和细胞核NF-κB p65蛋白的表达;用免疫荧光法检测NF-κB p65核转位情况。4.分别用LV-IRE1αsi RNA和空病毒(LV-empty)转染Raw264.7细胞后,用实时荧光定量PCR和Western blot检测转染后IRE1α的m RNA和蛋白的表达。5.用AngⅡ刺激转染后的Raw264.7细胞,用MTT法检测细胞增殖情况;Western blot检测P-IKKα/β、IκB和细胞核NF-κB p65蛋白表达;用实时荧光定量PCR检测促炎因子IL-6和TNF-α及和趋化因子MCP-1和CX3CL1的m RNA表达;用transwell实验检测细胞迁移能力的变化。结果一.动物实验结果(一)、血清生化分析造模16周后,与对照组比较,SNx组ApoE-/-小鼠血清尿素氮、肌酐和AngⅡ水平显著升高(P<0.01)。与SNx组比较,氯沙坦组ApoE-/-小鼠血清尿素氮、肌酐和AngⅡ水平明显降低(P<0.05)。(二)、HE染色结果造模16周后,SNx组ApoE-/-小鼠主动脉根部AS斑块面积与对照组相比明显增加(P<0.01)。氯沙坦组ApoE-/-小鼠主动脉根部AS斑块面积较SNx组显著减少(P<0.05)。(三)、炎症反应的变化与对照组相比,SNx组ApoE-/-小鼠主动脉根部AS斑块中巨噬细胞含量、外周血炎性单核细胞CD11b+Ly6C+细胞的比例以及主动脉中促炎因子和趋化因子的m RNA表达明显增加(P<0.01)。氯沙坦治疗能明显减轻上述改变(P<0.05)。(四)、评价内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)SNx组ApoE-/-小鼠主动脉根部AS斑块中P-IRE1α蛋白的表达以及主动脉GRP78蛋白的表达和IRE1α磷酸化明显高于对照组(P<0.01);而氯沙坦能显著降低SNx ApoE-/-小鼠粥样斑块中P-IRE1α的表达以及主动脉GRP78的表达和IRE1α磷酸化(P<0.05)。二.体外实验结果(一)、MTT法结果显示:1μg/ml浓度的AngⅡ对Raw264.7细胞增殖有促进作用,且以8h作用最为显著。(二)、AngⅡ刺激下Raw264.7细胞ERS标志性蛋白的变化AngⅡ以时间和剂量依赖的方式上调Raw264.7细胞GRP78的表达和IRE1α磷酸化,差异有显著性(P<0.05)。(三)、氯沙坦干预对AngⅡ刺激下Raw264.7细胞ERS的影响氯沙坦能明显抑制AngⅡ诱导的Raw264.7细胞GRP78表达及IRE1α的磷酸化(P<0.01)。(四)、氯沙坦干预对AngⅡ刺激下Raw264.7NF-κB信号通路的影响与对照组比较,AngⅡ能上调P-IKKα/β和细胞核NF-κBp65的蛋白表达以及细胞核内NF-κBp65蛋白的染色强度,差异有显著性(P<0.01)。氯沙坦能明显抑制AngⅡ的上述作用(P<0.01)。与对照组比较,AngⅡ能显著降低IκB的表达(P<0.01)。氯沙坦能明显抑制AngⅡ诱导的Raw264.7细胞IκB蛋白的减少(P<0.01)。(五)、抑制ERS对AngⅡ诱导的Raw264.7巨噬细胞炎症反应的影响1.实时荧光定量PCR和Western blot结果显示:与对照组比较,LV-IRE1αsi RNA组Raw264.7细胞IRE1α的m RNA和蛋白的表达明显下调(P<0.01)。LV-empty对IRE1α的表达无明显影响。2.MTT法结果显示:在AngⅡ刺激的Raw264.7细胞中,LV-IRE1αsi RNA组细胞的增殖能力明显低于AngⅡ组和AngⅡ+LV-empty组(P<0.01)。3.抑制内质网应激对AngⅡ诱导NF-κB信号通路的影响:在AngⅡ诱导细胞中,LV-IRE1αsi RNA转染后,与AngⅡ诱导组、AngⅡ+LV-empty组比较,降低了P-IKKα/β和细胞核NF-κBp65蛋白的表达及上调了IκB蛋白的表达,差异有显著性(P<0.01)。4.在AngⅡ刺激的Raw264.7细胞中,LV-IRE1αsi RNA组细胞促炎因子和趋化因子的m RNA表达量以及迁移细胞数量明显低于AngⅡ组和AngⅡ+LV-empty组(P<0.01)。结论1.RAS激活能促进CKD ApoE-/-小鼠AS的进展,上调主动脉ERS及炎症反应,提示RAS激活促进CKD ApoE-/-小鼠AS的进展可能与其上调主动脉ERS相关。2.AngⅡ以时间和剂量依赖的方式引起巨噬细胞ERS。3.AngⅡ通过AT1R/IRE1α/NF-κB通路诱导巨噬细胞炎症反应。4.本实验通过体内实验和体外实验两部分阐明了CKD ApoE-/-小鼠体内RAS活化与炎症的影响及其可能的机制,结合体内外的研究结果证实了RAS激活可通过上调ERS促进CKD ApoE-/-小鼠炎症反应,进而可推测RAS激活可能通过上调ERS相关性炎症促进CKD ApoE-/-小鼠的AS的发展,从而为CKD ApoE-/-小鼠中RAS激活促进AS的进展提供了新的机制。