基因治疗是将治疗型核酸药物输送到细胞中特定靶点来更改基因表达的过程,因具备高疗效低毒副作用的特点成为肿瘤等基因类疾病的理想治疗方法。基因治疗的临床应用受制于缺乏安全、高效基因输送载体。用于体内基因治疗的载体主要分为两类:病毒载体和非病毒载体。病毒载体是工程化改造后的病毒,能介导携带的基因在靶细胞中高效转染并长期表达,因而成为基因治疗临床试验中应用最多的载体。但病毒载体存在生物安全性隐患和生产困难等缺点,限制了其进一步应用。非病毒载体,特别是阳离子聚合物,具有低免疫原性和低毒性、通用性、容易扩大制备等优点。然而,阳离子聚合物的主要缺陷之一是在血清存在下基因转染效率会极大降低。以阳离子聚合物载体的金标准,分子量25kDa的枝状聚乙烯亚胺(bPEI25k)为例,其纳米复合物的转染效率会在血清存在下降低2-3个数量级。目前关于血清蛋白影响纳米复合物转染的机理已有研究,但仍存在争议且研究缺乏系统性。因此,在第二章,我们以bPEI25k为模型载体,研究了血清蛋白和牛血清白蛋白(BSA)对PEI纳米复合物理化特性及对基因转染的影响。血清蛋白或BSA吸附在PEI纳米复合物表面,形成了稳定的纳米复合物/蛋白壳层结构(将PEI/DNA及其纳米复合物/蛋白壳层结构统称为复合物),对包括尺寸、表面电荷、形貌结构和盐离子敏感性等理化特性进行了研究。以PEI/DNA/BSA质量比为1/1/0(PEI/DNA),1/1/4和1/1/40三种复合物为模型,进一步研究了转染过程和相应机理。结果显示,蛋白吸附层决定了复合物的内吞速率和途径、进入内含/溶酶体速率、囊泡逃逸效率和基因表达水平。PEI/DNA和1/1/4通过非降解型内吞途径,即分别以包膜窖介导的内吞途径和巨胞饮作用进入细胞,从而表现出高基因转染效率;1/1/40通过网格蛋白介导的内吞途径快速进入溶酶体中,由于无法从中逃逸被降解导致转染效率极低。在第三章,我们进一步研究了 PEI/DNA和1/1/4两种复合物在整体和单细胞水平上的基因表达。在整体细胞水平上,比较了两种复合物在不同孵育和转染时间下基因表达速率的差异、DNA浓度对转染水平(包括表达细胞百分比,表达水平)的影响及双质粒共表达的区别。在单细胞水平上,通过基于实时成像的单细胞分析技术,研究了细胞分裂对PEI/DNA和1/1/4两种复合物基因表达的影响、细胞分裂结束到表达起始时间(启动时间)的分布和单细胞基因表达模式。通过观察复合物的解离和入核,发现复合物能稳定存在于细胞质中,在细胞分裂时进入细胞核后开始解离转录。这种DNA在细胞质中稳定存在,并随细胞分裂持续入核的特性是细胞能持续启动表达的原因。与病毒载体相比,阳离子聚合物转染效率较低的主要原因是形成的纳米复合物无法在细胞内有效解离并快速释放DNA。阳离子聚合物对基因转染的影响较为复杂:尽管它能将DNA线团包裹形成纳米复合物,保护DNA免受核酸酶降解,并促进细胞内吞,但它与DNA之间的强静电相互作用导致纳米复合物过于稳定难以解离,从而无法快速释放DNA。阳离子聚合物甚至会与mRNA结合,干扰翻译过程。因此,在第四章,我们设计了细胞内降解去电荷型硫鎓聚合物用于基因输送。与基于胺类的阳离子聚合物(例如bPEI25k)不同,该聚合物能在细胞内降解成不带电的片段,使得复合物解离并快速释放出DNA,因而具备低细胞毒性和高表达效率。合成路线为先用“巯溴”点击反应制备含有苯硼酸/酯结构的硫醚聚合物,再用强烷基化试剂三氟甲磺酸甲酯反应定量得到硫鎓聚合物。通过改变单体投料比和化学结构,成功制备并表征了七种具有不同分子量、亲疏水性和活性氧自由基响应能力的降解去电荷型硫鎓聚合物。在第五章,我们进一步将该硫鎓聚合物用于肿瘤基因输送,并研究了其ROS相关的转染机理。形成的纳米复合物通过网格蛋白介导的内吞途径进入细胞后,能快速从内含/溶酶体中逃逸。在肿瘤细胞内高ROS浓度下,聚合物快速降解成电中性小分子片段,使得纳米复合物有效解离并释放DNA。我们阐明了聚合物结构与转染效率之间的构效关系。其中,硫鎓聚合物6CBE12k形成的纳米复合物在有血清条件下转染效率比bPEI25k高出2-3个数量级,表现出良好的血清抵抗性;在体内,6CBE12k能高效输送自杀基因pTRAIL到腹腔瘤中进行基因治疗,表现出优秀的抑瘤效果。