论文部分内容阅读
目的:ERK抑制剂PD98059可以降低脑缺血再灌注损伤产生的活性氧(Reactive oxygen species,ROS),发挥抗凋亡作用,但其作用机制是否与降低ROS、维持线粒体形态与功能的完整性有关尚未见报道。脑缺血再灌注使线粒体DNA受损,呼吸链复合物电子传递受破坏,组织中ROS生成增多,而过高水平的ROS反过来进一步破坏线粒体稳态,继而促进线粒体途径介导的细胞凋亡。我们前期的研究发现,脑缺血再灌注损伤大鼠模型脑组织中ERK的激活明显增加,细胞凋亡率也显著增高,而ERK抑制剂PD98059可以明显降低缺血再灌注大鼠脑组织中ROS的产生,发挥脑保护作用。因此我们设想PD98059保护缺血再灌注脑损伤的机制与其降低ROS的产生、维持线粒体的稳态有关。本实验采用体外构建缺糖缺氧再灌注细胞模型模拟体内的缺血再灌注损伤,于缺糖缺氧前给予不同剂量的PD98059,旨在探讨PD98059对抗缺缺糖氧再灌注损伤的机制是否与维持线粒体稳态有关。方法:取生长状态良好的神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)按一定的密度种板,培养24h后,将细胞随机分为五组,正常对照组(Control Group,Control)、DMSO 对照组(DMSO)、缺糖缺氧再灌注组(Oxygen-Glucose Deprivation/Resuscitation,OGD/R)、PD98059 低剂量组(PD-L)和 PD98059高剂量组(PD-H),DMSO组、PD-L组和PD-H组分别给与0.04%DMSO、10μM和20μM的PD98059,Control组和OGD/R组加入新鲜的完全培养基,24小时后,OGD/R组、PD-L组和PD-H组进行OGD/R处理,随后复氧24小时,Control组和DMSO组常规培养。实验指标如下:用蛋白免疫印迹法检测p-ERK、ERK蛋白的表达情况,观察ERK通路的激活;CCK-8法检测细胞的存活率,确定最佳缺氧时间;采用Hoechst33258对细胞核进行染色,观察细胞凋亡情况;应用Annexin V-FITC/PI染色及流式细胞学法测定双染SH-SY5Y细胞的凋亡率;检测凋亡蛋白Claved-caspase3/caspase3、Bcl-2和Bax的表达,进一步确定细胞凋亡情况;应用透射电镜观察线粒体的超微结构;荧光显微镜观察ROS和线粒体膜电位(mitochondrion membrane potential,MMP)的变化;采用紫外分光光度计检测T-SOD和MnSOD 的活性;Westernblot 检测线粒体蛋白 OPA1、MFN1、p-DRP1/DRP1及Cyto c的表达,观察线粒体融合分裂功能的变化。结果:1.在缺氧1h、2h、3h时,由Westernblot方法检测到p-ERK的表达量逐渐增加,ERK的表达量基本不变。2.在不同的缺氧时间下,凋亡蛋白Cleaved-caspase3的表达量随着缺氧时间的延长逐渐升高,Caspase3的表达不变。同时用CCK-8法检测了不同缺氧时间下细胞的存活率分别为:Control组:(100±0.33)%,缺糖缺氧1h(OGD 1h/R24h)组:(81±0.17)%,缺糖缺氧 2h(OGD 2h/R24h)组:(56±0.25)%,缺糖缺氧3h(OGD 3h/R 24h)组:(35±0.14)%,缺糖缺氧4h(OGD 4h/R24h)组:(26±0.10)%。可以看出随着缺氧时间的延长,细胞的存活率逐渐降低。3.加入ERK抑制剂PD98059后,p-ERK蛋白的表达明显被抑制,ERK的表达不变。同时Claved-caspase 3的表达显著降低,Caspase 3表达基本一致,且Bcl-2/Bax 比值逐渐升高。Hoechst染色观察到PD-L组和PD-H组的细胞核形态较ODG/R组核染色逐渐变浅,细胞核形态逐渐趋于正常,核固缩减少,核膜损伤降低。流式仪检测到细胞的凋亡率为:Control组为(8.5±5.2)%,DMSO 组为(13.4±5.8)%,OGD/R 组为(50.4± 10.7)%,PD-L 组为(37.6±1.1)%,PD-H 组为(27.9±4.6)%。DMSO vs Control:p>0.05;OGD/R vs Control:p<0.01;OGD/R vs PD-L:p<0.05;OGD/R vs PD-H:p<0.01。4.荧光显微镜观察到PD98059可以显著降低细胞内ROS的产生,使线粒体膜电位升高。紫外分光光度计检测显示OGD/R组中T-SOD和MnSOD的活性较Control组均显著降低(P<0.01);在PD-H组中,T-SOD的活性较OGD/R组明显升高(p<0.01),MnSOD的活性随着PD98059剂量的增加也逐渐升高。5.透射电镜观察到OGD/R组中,线粒体肿胀,出现空泡化,线粒体的嵴模糊不清;PD-L组和PD-H组中,线粒体空泡化逐渐减轻,外膜趋于完整,嵴逐渐清晰。6.Westernblot检测线粒体蛋白发现,OGD/R组中,MFN1、OPA1、p-DRP1、DRP1以及Cyto c的表达量均增加;在PD98059组中,随着药物浓度的增加,这些蛋白的表达量逐渐降低。结论:ERK抑制剂PD98059阻逆OGD/R引起的线粒体稳态失衡,保护线粒体形态和功能的完整性,从而抑制线粒体途径介导的细胞凋亡。