牛库布病毒(Bovine kobuvirus,BKV)属于小RNA核酸病毒科,库布病毒属,为无囊膜,单股正链RNA病毒。其直径在30 nm-40 nm之间,呈球形。目前GenBank数据库中有3条BKV基因组,分别来自日本,英国和埃及。研究数据表明BKV可能与牛腹泻有关,但是该病毒的致病性仍然还不清楚。自2003年BKV在日本被发现以来,该病毒已在10个国家被检测到,证明BKV有十分广泛的地域分布。BKV在奶牛中最高感染率可达77.8%,在肉牛中感染率为14%。2003年我国在奶牛腹泻粪便中首次发现BKV,经检测感染率高达34.9%。BKV的流行可能给我国的养牛行业的健康发展带来潜在的威胁。另外,牦牛作为我国青藏高原地区主要的牛种,还未见有关牦牛源BKV的报道。BKV作为一个新病毒,在我国的相关研究资料非常少。本研究主要对我国部分省份奶牛粪便样本进行分子检测,了解该病毒与奶牛腹泻的相关性及分子特征;了解青藏高原地区牦牛BKV的感染情况。取得的成果如下:1.完成了中国四个省区奶牛源BKV的分子检测和遗传进化分析为了了解我国部分省份犊奶牛的BKV的感染情况及分子特征。本研究样本收集自2018年1-4月份,分别来自于辽宁(3个奶牛场)、河南(3个奶牛场)、山东(3个奶牛场)、山西(5个奶牛场)4个省份的14个奶牛场共173份犊牛粪便样本(96份奶牛腹泻样本和77份奶牛非腹泻样本)。均来自2天-4月龄以内的犊牛。依据Jeoung H Y et al.报道的检测BKV RT-PCR方法进行检测。并以检测结果为阳性的样本核酸为模板,分别进行3D部分基因片段(552bp),完整VP1基因(801bp),VP0部分基因片段(660bp)进行扩增和分析。结果显示,173份粪便样本的阳性率为24.86%,奶牛场为64.29%,其中从96份腹泻样本中检测到34份BKV阳性(35.42%),从77份非腹泻样本中检测到的9份BKV阳性(11.69%)。奶牛腹泻粪样本BKV检出率显著高于非腹泻粪样的检出率(p<0.001)。在34例腹泻BKV阳性样本中有28例存在于其他常见腹泻病原共感染的情况。本研究得到的37个部分3D基因片段之间核苷酸序列同源性为92.6%-100%,推导的氨基酸序列同源性为97.0%-100%。另外,与GenBank数据库中登陆的其它3D序列相比,它们具有88.6%-96.4%的核苷酸序列同源性及其编码氨基酸序列同源性为92.4%-100%。进一步分析BKV 3D序列可分为两大支,本研究获得的毒株均分布在第一大支上,进一步又可以划分为10小支。另外本研究得到的15个完整的BKV VP1序列之间核苷酸同源性为74.2%-100.0%,推导的氨基酸同源性为80.1%-100.0%,与GenBank数据库中其它BKV VP1序列核苷酸序列同源性为72.9%-94.9%,推导的氨基酸同源性为80.5%-97.8%。进一步分析BKV VP1共分为8个谱系。本研究得到的7/15条序列分布在已知的谱系2上,其余的8/15条序列独立的集为3个新的分支,区别于已知的5个谱系。此外本研究获得的12个VP0部分基因片段序列之间具有78.5%-100%核苷酸序列同源性,推导氨基酸序列同源性84.1%-100%。与GenBank数据库中BKV VP0相比,具有80.2%-84.7%核苷酸序列同源性,推导的氨基酸序列同源性为85.0%-91.8%。进一步分析BKV VP0分为两个分支,本研究得到11个BKV序列独立的聚为一支,而另外一支由本研究得到的剩余一条VP0序列和GenBank数据库仅有的3条序列组成。另外,这11个本研究得到的BKV VP0序列与另一支中的序列相比均有一个氨基酸插入(S或N)。结果表明,BKV在中国分布较为广泛并且可能与腹泻有关。此外BKV在腹泻阳性本中共感染情况很严重;BKV 3D遗传多样性非常丰富,本研究获得的序列丰富了基因数据库;本研究获得8/15条BKV VP1序列独立分为的3个新的分支可能代表了3个新的谱系;这11/12个VP0序列与GenBank数据库仅有的3条VP0序列和本研究得到1/12个序列相比,表现出独特的氨基酸插入趋势。本研究的结果为进一步研究BKV的感染情况和分子特征提供了参考。2成功获得我国第一条BKV基因组为了进一步研究BKV基因组特征。本研究利用13对引物分段去扩增BKV基因组序列随后序列使用SeqMan软件进行组装。得到了一条包含完整ORF(7395 bp)长为7907 bp的近乎全长的BKV基因组。该基因组从一份来自河南的犊奶牛腹泻阳性样本中得到,命名为CHZ/CHINA(登录号为MK080265)。CHZ/CHINA ORF序列G+C含量占56.14%,编码了一个长度为2465个氨基酸组成的多聚蛋白。ORF的系统发育进化树表明,本研究所得到毒株CHZ/CHINA独立聚为一个分支上,区别于已知的3个BKV基因组。进一步分析CHZ/CHINA完整的VP0、VP3、VP1氨基酸系统发育进化树,结果均显示CHZ/CHINA独立聚为一支。表明该毒株与其他三个毒株有一定的遗传距离,可能代表了一个新的BKV型。本研究首次获得了我国第一条BKV基因组,有助于进一步了解BKV的分子特征和遗传进化。3成功建立了检测牛库布病毒的real-time RT-PCR方法现有相关数据表明BKV可能与牛的腹泻有关。而牦牛作为青藏高原地区主要的养殖动物,每年的4-5月份因腹泻引发的犊牛死亡率很高,给当地的牧民带来了严重损失,但是现在关于牦牛源BKV的任何流行病学调查还没见报道。在前期的工作中,本实验室将犊牦牛腹泻粪便样本用已有且仅有的3篇关于BKV RT-PCR方法报道的方法进行检测,结果并未检测到BKV,其原因可能是因为灵敏度不够高。为了建立一种更加灵敏的检测BKV的方法,本研究依据GenBank数据库的BKV 3D基因序列,设计了一对引物,通过反应体系和条件的优化,成功建立了一种检测BKV TB Green染料法real-time RT-PCR方法。经验证,此方法在4.86×10~8-4.86×10~2 copies/μL之间具有良好的线性关系,相关系数为0.9995,扩增效率为92.75%;此方法只特异性检出BKV,并且对其他常见无关腹泻病原不检出;最低检测下限为4.86×10~2 copies/μL;组内及组间的变异系数均小于2%。本研究所建立的方法对奶牛和牦牛腹泻粪便样本中BKV的检出率明显高于已有的3篇文献报道的RT-PCR方法。用该方法对采集自青海、西藏和四川藏区131份犊牦牛腹泻样本进行检测,结果显示,BKV样本的平均检出率为31.30%(青海、西藏和四川藏区的分别为44.44%、41.18%和13.46%,场分别为50%、100%和37.5%)。该研究首次成功建立了检测BKV的real-time RT-PCR方法,具有良好的特异性和稳定性且灵敏度高。为检测BKV提供了新的可靠的检测方法,同时证明了BKV在牦牛上的存在。