生物法拆分甲霜灵生产R-甲霜灵的研究

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甲霜灵是一种广谱性酰胺类手性杀菌剂,对一些作物的病原真菌引起的病害有良好的防治作用。它存在一对对映体异构体,杀菌活性主要来自于R-型。本研究从土壤中成功分离出一株用来拆分甲霜灵的菌株(含相应的酯酶),从细胞粗酶液中分离纯化得到胞内的酯酶蛋白,研究了其酶学性质,利用该菌细胞作为催化剂,设计出一条甲霜灵的拆分工艺路线,成功合成了高光学纯度R-甲霜灵。首先,从土样中分离得到一株能不对称水解甲霜灵的菌株,通过生理生化及分子生物学鉴定,确定其为Albibacters sp.zjut528。将菌株Albibacters sp.zjut528细胞破碎得到的粗酶液经硫酸铵沉淀、离子交换层析、凝胶过滤层析后,得到一个电泳纯的酯酶,酶活回收率为10.78%,纯化倍数为9.52。它在SDS-PAGE上呈单一条带,表观分子量约为40 kDa,通过转PVDF膜后进行N端测序,N端10个氨基酸序列为NH2-Ala-Ala-Lys-Ala-Pro-Leu-Arg-Leu-Lys-Glu。研究表明该酶最适活性温度约为40℃。20℃60℃稳定性较好,在上述温度下保温4 h保留90%的酶活。最适活性pH约为9.0。pH在5.010.0范围较稳定,4℃作用48 h仍保留90%的酶活。2mM Fe2+、Mn2+、Zn2+对酶活有轻微的促进作用,Fe3+对酶活有轻微的抑制作用。在含有10%的乙腈、异丙醇、丙酮、二异丙醚、环己烷、正己烷体系中酶活均比在纯水相中有较明显的提高。研究表明,该酶反应动力学符合米氏方程,最大反应速度Vm为0.05 g/(L·min),米氏常数Km为0.64 g/L,催化常数Kcat为0.85 min-1。利用Albibacters sp.zjut528菌体细胞作催化剂对甲霜灵进行拆分生成R-甲霜灵酸和S-甲霜灵,底物浓度5%(m/v),菌体浓度为1.5%(m/v),以20%异丙醇为助溶剂,反应28 h,转化率47.1%,产物R-甲霜灵酸的对映体过量值eep大于99%。然后,R-甲霜灵酸和甲醇进行酯化反应合成R-甲霜灵,产率80.1%,eep为99.4%。S-甲霜灵(ee为94%)进行消旋重新利用,消旋反应得到的甲霜灵对映体过量值ee为4.2%,转化率47.9%。
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