石油资源不可再生，利用可再生资源生产石油化工替代品是经济和社会发展的必然趋势。由于操作条件温和并且对环境无污染，利用微生物转化可再生资源生产生物能源和生物化工产品成为当今研究开发的重点。克雷伯氏菌能够以甘油为底物生产1，3-丙二醇，以糖类为底物生产2，3-丁二醇，因而受到较多关注，是生物能源开发过程中研究较多的一种菌。 本试验从克雷伯氏菌中分别克隆了与1，3-丙二醇的生物转化相关的1，3-丙二醇氧化还原酶基因dhaT和甘油脱水酶基因dhaB；并首次克隆了甘油脱氢酶基因gdh，将该基因序列提交GenBank(GenBank accession No．DQ985161)。利用pET28a载体将1，3-丙二醇氧化还原酶、甘油脱水酶和甘油脱氢酶基因分别在大肠杆菌中进行重组表达。经IPTG诱导，三株工程菌中重组1，3-丙二醇氧化还原酶的酶活为原始菌KGl的288倍；重组甘油脱水酶的酶活为KGl的4.2倍；重组甘油脱氢酶的酶活为KGl的887倍。对重组甘油脱氢酶的性质进行了研究，发现甘油脱氢酶的最适反应温度为37℃，最适底物为其天然底物——甘油，对一些具有邻位羟基的二元醇也有一定活性，而对其它二元醇和一元醇活性很低，在NH4+存在下具有最高的酶活。 为了研究甘油生物转化过程中不同关键酶对1，3-丙二醇生产的影响，构建了适用于克雷伯氏菌的表达质粒pUC18K，利用该质粒在克雷伯氏菌中分别过量表达1，3-丙二醇氧化还原酶、甘油脱水酶和甘油脱氢酶。在IPTG诱导条件下，与原始菌：KGl相比三株基因工程克雷伯氏菌中1，3-丙二醇氧化还原酶酶活提高了88倍，甘油脱水酶酶活提高了2.3倍，甘油脱氢酶酶活提高了94倍。质粒pUCl8K具有渗漏表达的特点，利用该质粒在克雷伯氏菌中渗漏表达三种酶，减少了外源添加IPTG的过程，同时避免了IPTG毒性对菌体的影响。在非IPTG诱导条件下重组克雷伯氏菌中1，3-丙二醇氧化还原酶、甘油脱水酶和甘油脱氢酶的酶活分别提高了81倍、2.3倍和86倍，与IPTG诱导条件下的酶活接近。发酵14 h，工程菌KGl/pUC18K-gdh发酵液中1，3-丙二醇的浓度比原始菌KGl提高了8.3％。而在克雷伯氏菌中过量表达1，3-丙二醇氧化还原酶或甘油脱水酶并没有提高1，3-丙二醇的浓度，反而带来了一定的代谢负担。在克雷伯氏菌中过量表达甘油脱水酶导致菌体生长缓慢，仅产生少量的1，3-丙二醇。其原因可能是由于甘油脱水酶活性的提高导致甘油快速大量转化为3-羟基丙醛，胞内3-羟基丙醛浓度的提高抑制菌体代谢，导致菌体生长缓慢和产生较少的1，3-丙二醇。从酿酒酵母中克隆得到合成甘油的关键酶基因：3-磷酸甘油脱氢酶基因gpdl和3-磷酸甘油酯酶基因hot2。利用二次PCR的方法构建了质粒pUCl8K-Pgpd1’+Phor2，利用该质粒在大肠杆菌和克雷伯氏菌中实现了3-磷酸甘油脱氢酶和3-磷酸甘油酯酶的共同表达。重组菌KGl/pUC18K-Pgpd1’+Phor2能够以葡萄糖为底物生产甘油。分别考察了接种量、温度、摇床转数、底物种类对重组克雷伯氏菌生产甘油的影响，确定了摇瓶培养优化条件为：2％接种量、37℃、200 rpm，葡萄糖为最适底物。此条件下发酵32小时，发酵液中甘油浓度为6.8 g/L，甘油得率为0.23 g甘油儋葡萄糖。葡萄糖分解代谢物阻遏是抑制甘油继续转化为1，3-丙二醇的主要原因。葡萄糖消耗完后添加氨水调节发酵液pH至7.0同时添加二羟基丙酮，发酵48 h后1，3-丙二醇浓度为0.41 g/L。发酵罐培养条件下克雷伯氏菌以葡萄糖为碳源进行生长时具有较大的生长速率，导致质粒丢失现象，不能实现甘油的积累。使用重组菌BL21/pUC1 8K-Pgpd1’+Phor2在3.7 L发酵罐上以葡萄糖为底物生产甘油，经过48小时发酵，发酵液中甘油浓度达到33.5 g/L，甘油得率为0.32 g甘油/g葡萄糖，生产能力为0.7g(L·h)。 本实验从克雷伯氏菌中克隆了α-淀粉酶基因malS，并在克雷伯氏菌中过量表达该蛋白，利用其蛋白序列自身信号肽分泌到发酵液中，首次实现了克雷伯氏菌直接以淀粉为底物生产2，3-丁二醇。使用SignalP 3.0分析蛋白序列，发现该淀粉酶前体的信号肽位于N-末端前17位氨基酸。分别考察接种量、发酵液初始pH和温度对以淀粉为底物生产2，3-丁二醇的影响，确定在5％接种量、发酵液初始pH 6.0、42℃条件下有利于2，3-丁二醇的产生。在此条件下摇瓶发酵24 h，发酵液中2，3-丁二醇浓度为3.8 g/L，产率为0.19 g2，3-丁二醇/g淀粉。