作为一种金属纳米材料,纳米镍因其独特的理化特性被应用于生物医药、催化剂和超级电容器等领域,由此产生的健康风险也引起人们极大的关注。有研究报道,全球范围内至少有3,000万男性患有不育症。人类精液质量下降和男性生殖健康已成为公共卫生领域高度关注的问题。生育能力在很大程度上受到环境因素的影响。纳米镍可经呼吸道和消化道进入人体,且已有多项流行病学研究证实其会对人体健康造成不良影响。因此,采用灌胃法和气管滴注法来研究纳米镍引起的雄性生殖毒性十分必要。微米镍是研究纳米镍毒性必需的微米级参照,而引入氯化镍可进行纳米颗粒与离子的对比。此外,本课题组前期研究还发现,纳米镍可引起生殖细胞毒性并诱导细胞凋亡,其损伤途径涉及线粒体介导的Caspase-9/Caspase-3凋亡信号通路。线粒体融合和分裂与细胞凋亡紧密相关,且线粒体自噬与细胞凋亡之间也存在着复杂的交互调控。所以我们推测,在纳米镍诱导生殖细胞凋亡过程中,线粒体分裂和线粒体自噬扮演着重要的角色。基于以上背景,本课题拟探讨纳米镍灌胃和气管滴注染毒的生殖毒性差异,并初步探讨在纳米镍诱导雄性生殖毒性过程中,线粒体动力相关蛋白1（Drp1）介导的线粒体分裂与PTEN诱导假定激酶1（Pink1）介导的线粒体自噬如何调控细胞凋亡。1、纳米镍对雄性小鼠的生殖毒性研究（1）纳米镍材料的表征运用马尔文激光粒度仪检测纳米镍的水合粒径和Zeta电位,显示水合粒径在200~1000 nm之间,Zeta电位分布在0 m V附近。运用扫描电子显微镜和透射电子显微镜检测纳米镍的形貌和尺寸,显示纳米镍颗粒呈球形,形状较规则,其粒径分布在30~100 nm之间,颗粒之间有明显的团聚现象。（2）灌胃法研究纳米镍对雄性小鼠的生殖毒性选择BALB/c雄性小鼠作为研究对象,参考课题组前期小鼠实验分组,分别设置生理盐水对照组、低剂量（5 mg/kg）、中剂量（15 mg/kg）、高剂量（45 mg/kg）纳米镍组,以及与高剂量纳米镍等镍质量分数的微米镍组（45 mg/kg）和氯化镍组（45 mg/kg）。分别用生理盐水配制纳米镍、微米镍和氯化镍的分散液,按照每只小鼠0.1 ml/10 g的原则进行灌胃染毒。每周染毒一次,持续28 d。染毒结束后,收集血清,检测生殖激素;取睾丸和附睾,计算睾丸脏器系数和精子畸形率,并检测睾丸病理形态以及线粒体分裂和线粒体自噬关键蛋白等指标。结果表明,各组小鼠的体重和睾丸脏器系数差异无统计学意义（P＞0.05）。各染毒组血清生殖激素睾酮（T）、促卵泡激素（FSH）和黄体生成素（LH）的含量均较对照组降低,差异有统计学意义（P＜0.05）。与对照组相比,各染毒组精子畸形率显著增加（P＜0.05）;而与高剂量纳米镍组相比,微米镍组和氯化镍组无统计学差异（P＞0.05）。睾丸组织HE染色切片显示,对照组曲细精管内的各级生精细胞排列整齐、结构清晰、层次分明,管腔内精子数量较多,间质细胞丰富。各染毒组曲细精管间隙增加,精子、生精细胞、间质细胞的数量均减少,还可观察到高剂量纳米镍组的曲细精管基底膜破裂,且微米镍组的曲细精管损伤更为明显。此外,各染毒组睾丸组织的Drp1、Pink1和Parkin的表达水平均高于对照组（P＜0.05）。（3）气管滴注法研究纳米镍对雄性小鼠的生殖毒性同样选取BALB/c雄性小鼠作为研究对象,剂量设置和分组方法与灌胃实验相同,即生理盐水组、低、中、高剂量纳米镍组、微米镍组和氯化镍组。同理,按照每只小鼠0.1 ml/10 g的原则,换算后按照每次40μl染毒液进行气管滴注染毒。收集血清、肺泡灌洗液、睾丸和附睾待测。结果表明,各组小鼠体重和睾丸脏器系数无统计学差异（P＞0.05）。各染毒组血清生殖激素T、FSH和LH水均较对照组下降,差异有统计学意义（P＜0.05）;氯化镍组生殖激素水平均高于高剂量纳米镍组（P＜0.05）。血清和肺泡灌洗液炎性因子TNF-α、IL-6和IL-1β水平均显著增加,且低剂量纳米镍组较其他组增加更明显（P＜0.05）。各染毒组精子畸形率随着纳米镍剂量增加而增加（P＜0.05）,而微米镍组和氯化镍组较高剂量纳米镍组均无统计学差异（P＞0.05）。睾丸组织病理改变与灌胃染毒较为相似,主要是生精细胞分布分散和排列紊乱,部分脱落到管腔中,间质细胞、生精细胞和精子数量减少。TUNEL法显示各染毒组睾丸组织中阳性凋亡细胞较对照组明显增多。此外,各染毒组睾丸组织Drp1、Pink1和Parkin的表达也较对照组上调（P＜0.05）。2、线粒体分裂和自噬在纳米镍雄性生殖毒性中的调控机制研究（1）纳米镍的细胞毒性研究分别设置空白对照组与低剂量（25μg/ml）、中剂量（50μg/ml）、高剂量（100μg/ml）纳米镍组,以及与高剂量纳米镍同浓度的微米镍组（100μg/ml）和氯化镍组（100μg/ml）。分别用完全培养液配制纳米镍、微米镍和氯化镍的分散液,作用于小鼠精原细胞（GC-1细胞）。染毒24 h后,采用CCK-8法和流式细胞术检测细胞活力和细胞凋亡率。结果表明,随着染毒剂量的增加,细胞存活率呈剂量依赖性下降（P＜0.05）,且微米镍组明显低于高剂量纳米镍组（P＜0.05）,氯化镍组略高于高剂量纳米镍组（P＞0.05）。细胞总凋亡率呈剂量依赖性升高,且微米镍组明显高于高剂量纳米镍组,而氯化镍组明显低于高剂量纳米镍组（P＜0.05）。（2）纳米镍的线粒体损伤研究不同浓度纳米镍染毒细胞后,采用活性氧（ROS）、腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）、线粒体膜电位（MMP）、线粒体自噬小体和线粒体分裂及线粒体自噬关键蛋白Drp1、Pink1和Parkin等指标反映线粒体损伤作用。结果显示,ROS水平随着纳米镍浓度的增加而增加;细胞内ATP含量呈剂量依赖性下降（P＜0.05）;MMP水平降低;线粒体自噬小体形成。Drp1、Pink1和Parkin以及细胞凋亡相关蛋白Bax、Caspase-9和Caspase-3的表达水平明显升高,而Bcl-2的表达水平下降,且Bax/Bcl-2的值呈剂量依赖性增加（P＜0.05）。（3）线粒体分裂和线粒体自噬的调控机制研究根据课题组前期细胞实验和动物实验结果,再次以GC-1细胞为研究对象,加入线粒体分裂抑制剂Mdivi-1,通过体外实验进一步探讨Drp1介导的线粒体分裂及Pink1介导的线粒体自噬在纳米镍致雄性生殖毒性中的作用及调控机制。CCK-8法检测结果证实,纳米镍浓度为100μg/ml时,细胞存活率在60%左右;Mdivi-1浓度为10μmol/l时,纳米镍染毒后的细胞存活率最高。因此,选择纳米镍浓度100μg/ml和抑制剂浓度10μmol/l进行后续实验。分别设置空白对照组、抑制剂组、纳米镍组和纳米镍与抑制剂联合组。加入Mdivi-1后,一系列细胞实验结果表明,与纳米镍组相比,纳米镍与抑制剂联合组的细胞活力显著增加（P＜0.05）,细胞总凋亡率显著降低（P＜0.05）,ROS水平有所下降,ATP含量增加（P＜0.05）,MMP有所升高。此外,与对照组相比,除了Bcl-2蛋白表达水平升高外,Drp1、Pink1、Parkin、Bax、Caspase-9和Caspase-3蛋白表达水平均下降,,且Bax/Bcl-2的比值显著下降（P＜0.05）。综上所述,纳米镍经灌胃和气管滴注染毒,均能引起雄性小鼠的生殖毒性,且纳米镍体内毒性大于微米镍,微米镍大于氯化镍;此外,线粒体分裂和自噬参与了生殖毒性过程。细胞实验发现,纳米镍还可诱导GC-1细胞凋亡并引起线粒体损伤。另外,还发现纳米镍可能通过促进线粒体分裂和自噬来诱导生精细胞凋亡,其机制可能是:颗粒作用于细胞后,Drp1介导的线粒体分裂增加,紧接着引起ROS堆积、ATP含量减少以及MMP下降,随后诱导Caspase-9和Caspase-3调控的线粒体凋亡通路,引起细胞凋亡的发生;同时线粒体分裂增加可激活Pink1介导的线粒体自噬通路。但是,线粒体自噬促进或保护细胞凋亡的机制尚不清楚,我们后续还将深入探讨。