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[目的]
我国海藻资源十分丰富,但海藻加工技术落后,应用研究项目太少,只能以饲料、琼胶和卡拉胶等低附加值的形式卖出,经济效益不明显。由于利润非常低,采集野生海藻的人少,使大部分野生海藻处于自生自灭的状态,海藻资源优势无法转化为经济优势。研究表明,半叶马尾藻多糖不仅有提高机体免疫功能、增强造血能力,而且具有清除自由基和减少脂质过氧化的抗辐射功能。如果开发成抗辐射口服液,既可以用于接受放疗的患者,拮抗电离辐射对正常组织的损伤,减少放疗患者的副作用;又可以用于接受阳光中紫外线较多的人群。本课题通过碘[131Ⅰ]化钠溶液腹腔注射小鼠制备辐射损伤模型,选用半叶马尾藻(sargassumhemiphyllum polysaccharides,SHP)提取多糖,配置成多糖口服液,检测其抗辐射作用,为开发海藻资源提供实验资料。
[方法]
1.半叶马尾藻多糖的提取、纯化、分离和鉴定
(1)用水煮醇沉法提取半叶马尾藻多糖
(2)Sevage法去蛋白纯化
(3)凝胶过滤柱层析分离得半叶马尾藻纯多糖的不同组份
(4)通过理化实验、ICP、紫外光谱扫描和溴化钾压片红外光谱测定等方法分析多糖的理化性质、微量元素、纯度和分子结构。
2.半叶马尾藻多糖口服液的制备
取适量半叶马尾藻多糖溶于水中,加入柠檬酸、白糖、蜂蜜,加热搅拌均匀,趁热过滤,再加入适量山梨酸钾,过滤,封口,高压灭菌20 min。
3.碘[131-Ⅰ]化钠溶液对小鼠免疫及造血功能的影响
(1)碘[131-Ⅰ]化钠溶液腹腔注射辐射损伤小鼠模型的建立
(2)黄嘌呤氧化酶法测定SOD、过氧化氢酶试剂盒测定CAT、硫代巴比妥酸法测定MDA
(3)流式细胞术检测小鼠胸腺和脾细胞周期
(4)MTT法检测小鼠胸腺和脾细胞自发增殖及ConA诱导的脾胸腺细胞增殖反应
(5)骨髓象和骨髓细胞周期的检测
4.半叶马尾藻多糖口服液对辐射损伤小鼠的抗辐射作用
(1)称重法检测小鼠胸腺和脾指数
(2)黄嘌呤氧化酶法测定SOD、过氧化氢酶试剂盒测定CAT、硫代巴比妥酸法测定MDA
(3)ELISA法检测小鼠血清IL-2
(4)流式细胞术检测小鼠胸腺和脾细胞周期
(5)血常规分析仪计数小鼠全血白细胞、红细胞、血红蛋白、血小板
(6)组织切片观察SHP对辐射损伤小鼠脾组织的影响
(7)MTT法检测小鼠胸腺和脾细胞自发增殖及ConA诱导的脾胸腺细胞增殖反应
(8)骨髓象及骨髓细胞周期的检测
[结果]
1.半叶马尾藻多糖的提取、纯化、分离和鉴定
应用热水浸提、乙醇沉淀、Sevage法去蛋白、凝胶过滤柱层析分离的方法从半叶马尾藻中成功提取出棕色粉末状多糖,提取率为6.56%,总糖含量为78.5%,提取纯化的半叶马尾藻多糖(SHP)是均一组分,纯度高。等离子体发射光谱分析表明SHP含多种有益人体的矿物元素,紫外光谱分析表明该多糖不含蛋白质,红外光谱分析表明SHP是一种酸性多糖,含有硫酸基、乙酰基、甘露糖基和葡萄糖基。
2.半叶马尾藻多糖口服液的制备
产品呈棕色,略有红糖味,味感协调柔和,酸甜适口,澄清透明,无沉淀,无肉眼可见的外来杂质。
3.碘[131-Ⅰ]化钠溶液对小鼠免疫及造血功能的影响
(1)碘[131-Ⅰ]化钠溶液腹腔注射后,小鼠胸腺细胞和脾细胞自发增殖和ConA诱导增殖能力下降,随着辐射剂量的增高,损伤作用越强。
(2)辐射损伤小鼠胸腺细胞和脾细胞均发生了G1期阻滞,而S期和G2/M期细胞百分数相对于正常对照组有显著减少,且呈剂量依赖关系。
(3)辐射损伤造成小鼠骨髓细胞发生G1期阻滞,细胞进入S期受阻,且呈剂量依赖关系;骨髓细胞损伤严重,尤其是粒系体积增大,核变性、溶解。
(4)辐射损伤小鼠的血液中超氧化歧化酶SOD及过氧化氢酶(CAT)的活性与正常对照组比较明显下降,丙二醛MDA的含量显著增高,且呈剂量依赖关系。
(5)确定辐射损伤适宜剂量为37Mbq。
4.半叶马尾藻多糖口服液对辐射损伤小鼠的抗辐射作用
(1)提前14 d预防性给予SHP口服液,辐射损伤小鼠胸腺和脾脏指数增高,胸腺细胞和脾细胞自发增殖和ConA诱导增殖明显得到改善,小鼠脾脏萎缩现象有所改善。
(2)辐射损伤小鼠胸腺和脾细胞G1期阻滞明显改善,S期和G2/M期细胞百分数有所增加,表明SHP口服液可以加快辐射损伤的淋巴细胞修复和增殖。
(3)辐射损伤小鼠IL-2明显增加。
(4)辐射损伤小鼠骨髓细胞G1期阻滞明显改善,S期和G2/M期细胞百分数有所增加;骨髓细胞数量增多,早幼粒、分叶核细胞增多,但可见微量的损伤细胞。
(5)辐射损伤小鼠血液中超氧化歧化酶SOD及过氧化氢酶(CAT)的活性明显增高,丙二醛MDA的含量显著降低。
[结论]
1.从半叶马尾藻中成功提取具有免疫活性的多糖。
2.高剂量的碘[131-Ⅰ]化钠溶液对小鼠免疫系统和造血系统有很强的杀伤作用。
3.半叶马尾藻多糖口服液对辐射损伤小鼠免疫功能及造血功能具有明显的抗辐射作用。