肝再生增强因子(Augmenter of liver regeneration,ALR)是一种特殊的促肝细胞分裂原，在肝损伤修复过程中起重要的作用。 肝脏疾病是危害人类健康的重大疾病之一。我国的肝炎、肝硬化及肝癌患者人数在1亿左右。且发病率在逐年上升，据1999年统计，发病率在12％左右。因此，为解除肝病患者的痛苦，研究一种医治肝病的新药迫在眉睫。1987年以来，我国学者应用胎肝的混悬液，治疗各种肝病取得了明显的疗效。由此启发并说明胎肝中含有肝细胞的增殖刺激因子。1994年Hagiya等人从初断乳大鼠的肝胞液中分离出一种能促进肝细胞增殖的一种热稳定性细胞因子，命名为肝细胞再生增强因子。 本论文应用基因工程的手段克隆、表达并纯化了人的肝再生增强因子基因(hALR)。为进一步研究它的生物学功能打下了基础。并通过建立大鼠肝纤维化模型和小鼠的脂肪肝损伤的模型，较系统的研究了基因克隆方法获得的人肝细胞再生增强因子基因的生物活性，为使hALR尽早应用于临床治疗肝病奠定了基础。结果如下： 1．首次从6个月胎肝中提取hALR基因的总的RNA，采用RT-PCR的方法克隆了hALR的完整阅读框的cDNA片段。由测序结果得知，重组子片段是由378个碱基组成的，有2个碱基发生了突变，未导致氨基酸发生变化。 2．首次构建了重组ALR原核表达载体，获得了pET28a-hALR的重组表达质粒，并测序证实。 3．首次对pET28a-hALR基因进行了IPTG梯度的诱导表达，不同浓度的诱导剂IPTG诱导表达表明，当IPTG浓度为1M时，表达量最高；首次对pET28a-hALR基因进行了时间梯度的诱导表达。经过不同时间的诱导表达表明，诱导时间在3小时时表达量最高。 4．首次对pET28a-hALR基因表达部位进行了分析。原核表达的蛋白质无论在沉淀中还是在上清中均有表达。在沉淀中较在上清中表达得多。即蛋白质在大肠杆菌细胞内表达量大，而且主要是以包含体的形式存在。 5．通过表达蛋白质的免疫印迹检测(Western-blot检测)，证明表达出了18.7KD的融合型目的蛋白。Westen-blot杂交显色反应，结果在20.1KD附近有一明显的黑色斑点，正是hALR与其抗体结合后所表达的目的蛋白。 6．用NI离子交换树脂对表达的pET28a-hALR蛋白质进行了纯化。纯化的蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，证明了目的蛋白被纯化出来了。 7．首次通过建立人血白蛋白免疫损伤性大鼠肝纤维化模型，研究rhALR对肝纤维化的生物活性作用。结果表明，rhALR对免疫损伤性大鼠肝纤维化的组织增生有明显的抑制作用，在免疫性肝纤维化过程中，给予rhALR可使血清中ALT，AST，LDH水平明显降低。保护了人血白蛋白所致的大鼠肝细胞的慢性免疫性损伤。 8．首次通过建立乙硫氨酸引起的小鼠的脂肪歼损伤的模型，观察rhALR对脂肪肝损伤的生物活性作用。结果表明，rhALR可抑制小鼠脂肪肝时ALT，AST，LDH活性升高，同时降低TG、TCH的含量，hALR对乙硫氨酸引起的小鼠脂肪肝有治疗作用。 东北农业大学理学博士学位论文一 9．通过基因工程的方法可以大量的生产11Hut，不仅大大陶氏了成本，而且克服了生u剂的缺点：纯度低、含杂质、成本高、易出现过敏反应等。同时也解决了胎肝来源受限的问题。为重组人肝再生增强子基因的药品开发和临床应用奠定了 出。 10利用酶联免疫吸附的方法检测不同类型肝病患者血清中ALR水平。尝试了一种较快速的检现9 患者血清中ALR水平的方法。本实验结果表明，肝病患者血清中影氏可检测到 ALR水平的浓度为 0．2 u叭，最高是9．2 u g／L。发现ALR抗体与 ALR抗原反应呈较好的线性正相关。提示ELISA j3i：．；y测外周血清中ALR水平具有良好的敏感性和特异性。