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婴幼儿血管瘤(Infantile hemangioma, IH)是婴幼儿最常见的良性肿瘤之一。该病的发病率约为3-10%,其中女性、白种人、低体重的早产儿、多胞胎、高龄产妇的婴幼儿更易患病。根据病程的发展以及病理的变化,可以将IH分为增殖期、消退期、消退完成期。血管瘤的瘤体快速增长期往往在出生后的前5个月,以伴有血管内皮细胞的大量增殖为特点。大约10%的IH可以在1年内自行完成退化,而余下的90%的IH则需要9-10年,甚至更长的时间才能完全消退。IH为良性肿瘤,存在一定的自行消退的倾向,但目前关于IH自行消退的机制尚不完全清楚。microRNA属于小分子单链RNA,在真核细胞的基因表达调控中有着广泛的作用。我们前期对不同病程IH患儿的瘤体标本进行基因芯片分析,发现：miR-206是IH病程中是表达差异最大的一个miRNA,其含量在病程发展过程中逐渐升高,消退完成期水平是消退期的24倍。这就提示miR-206可能是IH自发消退的重要转录后调节因子。转化生长因子β (Transforming growth factor, TGFβ)信号通路在肿瘤发生和血管生成中具有重要的调控作用。对于IH这一血管内皮细胞源性肿瘤而言,TGFβ信号通路在病程的发展变化过程中起着重要作用。现研究表明：TGFβ在IH增生早期和消退晚期呈现弱表达,而在增生中晚期和消退早期则表现为强表达,提示TGFβ可能参与了IH血管内皮细胞增殖的负向调控,并在瘤体自发消退过程中起到了促进作用。然而,目前对TGFβ的具体调节机制尚不清楚。基于以上考虑,本课题以miR-206和TGFβ信号通路为研究对象,探究二者二者的关系,以及二者对婴幼儿血管瘤内皮细胞(Infantile hemangioma endothelial cells, HemEC)的影响,探究IH的消退机制。第一部分人脐静脉内皮细胞和婴幼儿血管瘤血管内皮细胞的分离、培养与鉴定实验目的分离、纯化、培养并鉴定人脐静脉内皮细胞和婴幼儿血管瘤血管内皮细胞两组细胞。实验方法1.收集1cm长人脐带标本,人脐静脉组织块直接粘附于皿底原代培养10d,通过镜下观察爬出的细胞形态,鉴别标记出形态规则如铺路石样细胞及组织块,挑出目的组织块,重新独立贴壁培养约3-4d,收集获得的细胞进行传代,扩增,保存。2.收集获取婴幼儿血管瘤手术后标本,通过血管瘤组织块颗粒原代培养6-7d,将爬出的细胞收集、培养、传代。待细胞量充足时,通过CD31免疫磁珠进行分选纯化,得到婴幼儿血管瘤来源的CD31表达阳性的细胞。3.将两组细胞的细胞形态学比较,并测定细胞生长曲线以比较生长特性。通过血管内皮细胞Matrigel基质胶成管实验、内皮细胞乙酰低浓度脂蛋白的摄取实验、细胞免疫荧光检测及细胞表面抗体的流式检测对组织块法培养的细胞进行鉴定。实验结果1.人脐静脉组织块法培养并依据镜下形态分选纯化获得的人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cell, HUVEC),经流式细胞仪检测CD31阳性率达97%。2.增殖期婴幼儿血管瘤组织块培养法并经过免疫磁珠分选获得的HemEC,经流式细胞仪检测CD31阳性率达93.0%。3.两种细胞内吞实验均为阳性,生长曲线测定显示HemECs较HUVEC的增殖能力更强。4.成管实验显示HemEC较HUVEC具有更快的成管特性,较早出现管型,较早出现细胞聚集变化。5.细胞免疫荧光显示两组细胞CD31, CD 105, VEGF, GLUT1, vWF均表达阳性。实验结论我们证实通过收集的lcm人脐带标本,组织块法培养经细胞形态分选获得的细胞,经鉴定为HUVEC;通过收集增殖期婴幼儿血管瘤组织标本,组织块法培养经免疫磁珠分选获得的细胞,经鉴定为HemEC。细胞分离纯化的方法简便高效,获得的细胞纯度高,状态好,数量充足。HemEC的增殖能力较HUVEC细胞更强,HemEC的成管能力较HUVEC细胞更快。第二部分miR-206对婴幼儿血管瘤血管内皮细胞增殖的影响实验目的了解miR-206对HemEC增殖和凋亡能力的影响。实验方法1.转染miR-206 mimics, miR-206 mimics NC, miR-206 inhibitor, miR-206 inhibitor NC至HUVEC和HemEC中8h,通过倒置荧光显微镜拍照分析转染效率。2.转染后24h后,使用RT-PCR技术,借助于Taqman探针和SYBR Green染料检测各组细胞中的miR-206含量。3.通过CCK-8法检测转染后HemEC的增殖能力。4.借助PI染料和AnnexinV-FITC/PI染料,使用流式细胞仪检测miR-206对HemEC细胞周期的影响以及细胞凋亡的影响。实验结果1.转染后的荧光分析显示miR-206 mimics成功转染,转染效率高。2. TaqMan探针法RT-PCR检测显示miR-206 mimics转染后miR-206的表达水平约是阴性对照组miR-206 NC的50000倍,显著上调了HUVEC中的miR-206的表达水平(P<0.001); miR-206的表达水平约是阴性对照组miR-206 NC的7500倍,显著上调了HemEC中的miR-206的表达水平(P<0.001)。3. SYBR Green法RT-PCR检测显示miR-206 mimics转染后,miR-206的表达水平约是阴性对照组miR-206 NC的70000倍,显著上调了HUVEC中的miR-206的表达水平(P<0.001)；miR-206的表达水平约是阴性对照组miR-206 NC的约100000倍,显著上调了HemEC中的miR-206的表达水平(P<0.001)4.CCK-8法检测显示miR-206转染后的HemEC的细胞增殖活性明显下降(P<0.05),24h时miR-206抑制增殖能力最为显著(P<0.01)。5.细胞周期检测显示miR-206可使HemEC的S期比例下降,G2期比例增加。6.细胞凋亡检测显示miR-206使HemEC的凋亡比例变化不明显。实验结论miR-206 mimics可显著上调内皮细胞内miR-206的表达。提高miR-206的表达可有效抑制HemEC的细胞增殖,将细胞周期阻滞于G2期,但不能明显诱导HemEC的凋亡。第三部分miR-206抑制婴幼儿血管瘤血管内皮细胞的增殖的机制研究实验目的了解miR-206抑制婴幼儿血管瘤血管内皮细胞增殖的机制。实验方法1.通过KEGG数据库,分析miR-206具有调控作用的相关信号通路分析。2.通过Elisa法检测miR-206转染后HemEC后上清培养液中TGFβ1、TGFβ2、 TGFβ3以及BMP2、BMP4、BMP7的含量。3.借助于SYBR染料,使用RT-PCR分析miR-206转染HemEC后细胞内的smad2、smad4、smad7基因的mRNA表达水平。4.通过Western-blot检测miR-206转染HemEC后smad2、pp-smad2、smad4、 smad7蛋白表达水平。5.使用CCK-8法检测TGFβ1对HemEC增殖能力的影响。6.通过流式细胞仪检测TGFβ1对HemEC细胞周期的影响。7.通过流式细胞仪检测不同浓度的TGFβ1对HemEC细胞凋亡的影响。实验结果1.依据信号通路分析结果,结合miR-206可能的目标通路,选择TGF-beta signaling pathway作为研究对象。2.Elisa法检测显示miR-206 mimics转染后HemEC分泌的TGFβ1的含量较阴性对照组miR-206 NC显著提高(P<0.001), miR-206抑制剂转染后HemEC分泌的TGFβ1,的含量较阴性对照组miR-206 inhibitor NC显著下降(P<0.001)。3. RT-PCR检测显示上调HemEC中miR-206的表达可使smad7的基因表达显著增多(P<0.01),下调HemEC中miR-206的表达可使smad7的基因表达明显减少(P<0.05)。4. Western-blot检测显示上调HemEC中miR-206的表达可使smad7的蛋白表达增多,下调HemEC中miR-206的表达可使smad7的蛋白表达减少。5.CCK-8法检测显示TGFβ1浓度越高,抑制HemEC增殖越显著(P<0.01),同一浓度TGFβ1共培养的时间越长抑制细胞增殖的能力越强(P<0.05)。6.细胞周期检测显示TGFβ1可使HemEC的S期比例增加。7.细胞凋亡检测显示不同浓度TGFβ1使HemEC的凋亡比例变化不明显。随着TGFβ1浓度的升高,HemEC的凋亡比例微升,但HemEC的凋亡比例变化无统计学意义。实验结论提高HemEC细胞内miR-206的表达可上调TGFβ1含量,上调smad7的蛋白表达。TGFβ1可明显可抑制HemEC的增殖活性,且其对细胞增殖活力的抑制作用随TGFβ1浓度的升高而增加。5ng/mLTGFβ1可以诱导细胞周期阻滞,出现S期阻滞,但TGFβ1诱导HemEC细胞凋亡作用并不明显。综上,miR-206可抑制HemEC的增殖,是IH的病程发展中重要的调控因子之一,其作用途径是通过上调HemEC中miR-206的表达从而正向调节TGFβ信号通路中TGFβ1及smad7的水平实现的。