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猪δ冠状病毒(PDCoV)是近年新发现的δ冠状病毒属成员，可引起哺乳仔猪腹泻、呕吐和脱水。该病毒于2012年在猪群粪便中首次被检测到，于2014年在美国猪场首先暴发，其后在美国多个州、中国、韩国、加拿大、日本、越南、泰国、老挝等地猪场均检测到该病毒，给养猪业带来严重的经济损失。目前，关于PDCoV的流行情况、感染特性、免疫致病机制等尚不清楚。本试验从河南某腹泻猪场的仔猪粪便中检测到PDCoV，对其中一株（河南流行株HNZK-02）进行了全基因组扩增测序，并进行了遗传进化分析研究，其后将细胞适应毒PDCoVHNZK-02在不同种类的鸡胚和SPF鸡上进行人工感染试验，了解PDCoV对鸡胚及SPF鸡的感染性情况。具体内容如下:
1.PDCoV河南流行株HNZK-02的全基因组测序及遗传进化分析
本试验采集河南周口某猪场仔猪的腹泻样品，经RT-PCR检测PEDV、TGEV、PRRSV、PRV、PCV等病毒均为阴性，仅PDCoV阳性。参照GenBank PDCoV HKU15-155株的全基因序列设计合成了13对引物，运用RT-PCR进行全基因扩增，将获得的目的片段克隆至pMD-18T载体，构建重组质粒后进行测序，获得了PDCoV河南流行株HNZK-02的全基因序列（GenBank登录号:MH708123）。PDCoV HNZK-02株基因全长为25419bp，GC含量为43.06％，基因组结构为5(UTR)-OFRl a-OFRl b-S-E-M-NS6-N-NS7-3URT，其基因长度从5端非编码区序列起分别为539、18803、3480、252、654、285、1029、603和392bp。应用DNAStar软件对PDCoV HNZK-02株进行氨基酸同源性分析，结果表明PDCoVHNZK-02株与其它PDCoV流行株的全基因组氨基酸同源性为74.7％-99.4％，N基因氨基酸同源性为97.4％-99.6％，S基因氨基酸同源性为98％-99.6％。;其中PDCoVHNZK-02株与中国其它的PDCoV流行株的氨基酸同源性最高，而与东南亚参考毒株氨基酸同源性最低。与国内外PDCoV毒株相比，HNZK-02株的N基因共发生7处核苷酸突变，1处氨基酸突变;S基因上有6处氨基酸发生突变，1处发生氨基酸缺失;进一步对PDCoV HNZK-02株的S蛋白进行抗原表位分析，发现在550位的氨基酸突变导致了抗原表位发生变化，这种变化明显区别于美国、东南亚、其他中国代表性毒株。
将PDCoV HNZK-02株和NCBI中35株PDCoV代表毒株序列进行PDCoV全基因组、S和N基因的遗传变异分析，结果表明PDCoV可分为三个大的亚群:美国亚群、中国亚群和东南亚亚群。中国亚群又可分为两个小亚群，其中PDCoV HNZK-02株和江西、江苏等毒株处于同一小亚群，。N基因进化树显示PDCoV可分为两个大亚群，，其中PDCoV HNZK-02株与美国、韩国、中国台湾、江西、江苏、黑龙江毒株均处在同一亚群，该结果对于了解河南省PDCoV的分子流行规律及分子遗传特征具有重要意义。
2.PDCoV细胞适应性毒对鸡胚感染性研究
PDCoV的感染谱尚不明确。为了验证PDCoV是否能感染鸡胚，本部分研究将PDCoV（8.62log10GE，300μL/胚）经尿囊腔接种11日龄的肉鸡胚、蛋鸡胚以及SPF鸡胚，37℃孵化箱中孵育3天后，收取鸡胚的尿囊液及其肠道组织，应用RT-PCR检测鸡胚尿囊液及肠道中的PDCoV;将检测阳性的鸡胚肠道研磨液接种同种鸡胚进行传代，通过荧光定量PCR检测每代鸡胚肠道病毒含量。试验结果表明，PDCoV可以在肉鸡胚、蛋鸡胚以及SPF鸡胚的尿囊液和肠道中检测到，并可以在鸡胚中连续传代，在肉鸡胚中经过6次传代，仍能检测到病毒RNA，病毒RNA滴度为5.22-6.70log10GE/ml。
3.PDCoV HNZK-02株对SPF鸡感染性研究
为进一步了解PDCoV是否可以感染鸡，将PDCoVHNZK-02人工感染3日龄SPF鸡，通过点眼、滴鼻和经口灌服的方式接种PDCoVHNZK-02（10.5log10GE，500μL/只）。在攻毒后3、5、7、14和17d随机剖检攻毒组与对照组各6只鸡，运用RT-PCR与荧光定量PCR检测病毒的组织分布，以及粪便中的排毒情况，用HE染色法对各组织脏器进行组织病理学观察。结果显示，SPF鸡在攻毒后2～5天(dpi)表现为轻、中度腹泻;粪便排毒从2dpi开始，在4dpi病毒含量达到峰值，至7dpi结束;主要在肺脏、肾脏、肠内容物与肠道组织（包括盲肠、空肠和直肠）中检出PDCoV病毒RNA。肺脏、肾脏在3dpi检出PDCoV，直至17dpi仍可检出;肠内容物在5dpi检出PDCoV，至17dpi病毒RNA含量仍保持在较高水平;空肠在3dpi检出PDCoV，病毒RNA自3dpi开始含量逐渐增加，在10dpi达到最大值后下降，直至17dpi仍可检出;盲肠在5dpi检出PDCoV，，5dpi病毒RNA达到最高水平，后逐渐下降，17dpi依然能检出;直肠在5dpi检出PDCoV，7dpi病毒RNA含量达到最高水平，后下降，17dpi检测仍可检出较低病毒RNA含量。在组织病理学分析发现对照组中SPF鸡各组织脏器正常，攻毒组肾小管坏死，出现颗粒样变性，肺间隔增宽，空肠黏膜层肠绒毛脱落，肠道上皮细胞变性坏死，盲肠粘膜层肠绒毛脱落，肠隐窝呈弥散性坏死，大量淋巴细胞浸润，直肠隐窝坏死。表明PDCoV可以感染SPF鸡，且病毒在鸡体内有较广泛的组织嗜性。
综上所述，试验对PDCoV河南流行毒株HNZK-02进行了全基因组测序，并对其进行了遗传变异分析对明确河南省PDCoV的分子流行规律及分子遗传特征分析提供了重要依据。将PDCoV分别接种不同类型的鸡胚、SPF鸡，证实PDCoV可感染鸡胚与SPF鸡，并表现出较广泛的组织嗜性。这些结果为PDCoV溯源、宿主范围确定以及跨种传播机制研究提供了重要信息，同时为PDCoV的防治及疫苗研发提供了重要的理论依据。
1.PDCoV河南流行株HNZK-02的全基因组测序及遗传进化分析
本试验采集河南周口某猪场仔猪的腹泻样品，经RT-PCR检测PEDV、TGEV、PRRSV、PRV、PCV等病毒均为阴性，仅PDCoV阳性。参照GenBank PDCoV HKU15-155株的全基因序列设计合成了13对引物，运用RT-PCR进行全基因扩增，将获得的目的片段克隆至pMD-18T载体，构建重组质粒后进行测序，获得了PDCoV河南流行株HNZK-02的全基因序列（GenBank登录号:MH708123）。PDCoV HNZK-02株基因全长为25419bp，GC含量为43.06％，基因组结构为5(UTR)-OFRl a-OFRl b-S-E-M-NS6-N-NS7-3URT，其基因长度从5端非编码区序列起分别为539、18803、3480、252、654、285、1029、603和392bp。应用DNAStar软件对PDCoV HNZK-02株进行氨基酸同源性分析，结果表明PDCoVHNZK-02株与其它PDCoV流行株的全基因组氨基酸同源性为74.7％-99.4％，N基因氨基酸同源性为97.4％-99.6％，S基因氨基酸同源性为98％-99.6％。;其中PDCoVHNZK-02株与中国其它的PDCoV流行株的氨基酸同源性最高，而与东南亚参考毒株氨基酸同源性最低。与国内外PDCoV毒株相比，HNZK-02株的N基因共发生7处核苷酸突变，1处氨基酸突变;S基因上有6处氨基酸发生突变，1处发生氨基酸缺失;进一步对PDCoV HNZK-02株的S蛋白进行抗原表位分析，发现在550位的氨基酸突变导致了抗原表位发生变化，这种变化明显区别于美国、东南亚、其他中国代表性毒株。
将PDCoV HNZK-02株和NCBI中35株PDCoV代表毒株序列进行PDCoV全基因组、S和N基因的遗传变异分析，结果表明PDCoV可分为三个大的亚群:美国亚群、中国亚群和东南亚亚群。中国亚群又可分为两个小亚群，其中PDCoV HNZK-02株和江西、江苏等毒株处于同一小亚群，。N基因进化树显示PDCoV可分为两个大亚群，，其中PDCoV HNZK-02株与美国、韩国、中国台湾、江西、江苏、黑龙江毒株均处在同一亚群，该结果对于了解河南省PDCoV的分子流行规律及分子遗传特征具有重要意义。
2.PDCoV细胞适应性毒对鸡胚感染性研究
PDCoV的感染谱尚不明确。为了验证PDCoV是否能感染鸡胚，本部分研究将PDCoV（8.62log10GE，300μL/胚）经尿囊腔接种11日龄的肉鸡胚、蛋鸡胚以及SPF鸡胚，37℃孵化箱中孵育3天后，收取鸡胚的尿囊液及其肠道组织，应用RT-PCR检测鸡胚尿囊液及肠道中的PDCoV;将检测阳性的鸡胚肠道研磨液接种同种鸡胚进行传代，通过荧光定量PCR检测每代鸡胚肠道病毒含量。试验结果表明，PDCoV可以在肉鸡胚、蛋鸡胚以及SPF鸡胚的尿囊液和肠道中检测到，并可以在鸡胚中连续传代，在肉鸡胚中经过6次传代，仍能检测到病毒RNA，病毒RNA滴度为5.22-6.70log10GE/ml。
3.PDCoV HNZK-02株对SPF鸡感染性研究
为进一步了解PDCoV是否可以感染鸡，将PDCoVHNZK-02人工感染3日龄SPF鸡，通过点眼、滴鼻和经口灌服的方式接种PDCoVHNZK-02（10.5log10GE，500μL/只）。在攻毒后3、5、7、14和17d随机剖检攻毒组与对照组各6只鸡，运用RT-PCR与荧光定量PCR检测病毒的组织分布，以及粪便中的排毒情况，用HE染色法对各组织脏器进行组织病理学观察。结果显示，SPF鸡在攻毒后2～5天(dpi)表现为轻、中度腹泻;粪便排毒从2dpi开始，在4dpi病毒含量达到峰值，至7dpi结束;主要在肺脏、肾脏、肠内容物与肠道组织（包括盲肠、空肠和直肠）中检出PDCoV病毒RNA。肺脏、肾脏在3dpi检出PDCoV，直至17dpi仍可检出;肠内容物在5dpi检出PDCoV，至17dpi病毒RNA含量仍保持在较高水平;空肠在3dpi检出PDCoV，病毒RNA自3dpi开始含量逐渐增加，在10dpi达到最大值后下降，直至17dpi仍可检出;盲肠在5dpi检出PDCoV，，5dpi病毒RNA达到最高水平，后逐渐下降，17dpi依然能检出;直肠在5dpi检出PDCoV，7dpi病毒RNA含量达到最高水平，后下降，17dpi检测仍可检出较低病毒RNA含量。在组织病理学分析发现对照组中SPF鸡各组织脏器正常，攻毒组肾小管坏死，出现颗粒样变性，肺间隔增宽，空肠黏膜层肠绒毛脱落，肠道上皮细胞变性坏死，盲肠粘膜层肠绒毛脱落，肠隐窝呈弥散性坏死，大量淋巴细胞浸润，直肠隐窝坏死。表明PDCoV可以感染SPF鸡，且病毒在鸡体内有较广泛的组织嗜性。
综上所述，试验对PDCoV河南流行毒株HNZK-02进行了全基因组测序，并对其进行了遗传变异分析对明确河南省PDCoV的分子流行规律及分子遗传特征分析提供了重要依据。将PDCoV分别接种不同类型的鸡胚、SPF鸡，证实PDCoV可感染鸡胚与SPF鸡，并表现出较广泛的组织嗜性。这些结果为PDCoV溯源、宿主范围确定以及跨种传播机制研究提供了重要信息，同时为PDCoV的防治及疫苗研发提供了重要的理论依据。