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背景早发性卵巢功能不全(Premature ovarian insufficiency,POI)是女性在40岁以前出现的卵巢功能衰退的表现,以月经稀发或者停经,同时伴有高促性腺激素和低雌激素的临床特征。染色体和基因缺陷、自身免疫性卵巢损伤、感染性因素、医源性因素(主要是手术、化疗和放疗等)均可以引起POI,尚有一些不明确病因的称为特发性POI。POI患者发生骨质疏松、心血管疾病、认知功能障碍、泌尿生殖综合征、生育功能下降等风险增高。目前治疗以改善生活方式、激素补充等为主,但是尚无确切的方法能够改善生育功能。对年轻恶性肿瘤女性,可以在放化疗前进行冷冻卵母细胞、卵巢组织或胚胎,以保存生育能力,但有携带肿瘤细胞的风险。人羊膜间充质干细胞(Human amnion-derived mesenchymal stem cells,h AD-MSC)来源人羊膜,在体外有三向分化的能力,免疫原性低,可以分泌多种因子,课题组及国内外的研究证实尾静脉注射h AD-MSC可以改善POI动物的卵巢功能,但是细胞移植进入体内后,最终到达靶器官的归巢率低。因此本课题拟通过卵巢原位移植h AD-MSC治疗大鼠POI,增加归巢到卵巢的h AD-MSC数量,并对改善POI功能可能的机制进行初步研究。方法:(1)从人胎盘羊膜分离h AD-MSC后进行培养,观察细胞形态特征,进行多向诱导分化培养。(2)筛选SD大鼠POI模型:将体重在240-260g且具有正常动情周期的160只大鼠随机分为10组,选取常用的4种建立动物POI模型的药物方案(顺铂、环磷酰胺、白消安和4-乙烯基环己烯双环氧化合物(4-vinylcyclohexene diepoxide,VCD))进行建模,并对不同建模方案进行对比研究。1)顺铂致POI模型方案:32只大鼠被随机分为2组,给予顺铂实验组腹腔注射顺铂(2mg/kg,连续6天),同时给予顺铂对照组腹腔注射等体积生理盐水。2)白消安联合环磷酰胺致POI模型方案:48只大鼠被随机分为3组。给予白消安联合环磷酰胺实验组单次腹腔注射环磷酰胺(83.52mg/kg)和白消安(20.88mg/kg),同时分别给予对照组(生理盐水组、蓖麻油组)腹腔分别注射等体积生理盐水和蓖麻油。3)环磷酰胺单用致POI模型方案:32只大鼠被随机分为2组,给予环磷酰胺实验组首次腹腔注射环磷酰胺基础量(50mg/kg)后,以8mg/(kg·d)连续注射14天,同时每天给予对照组腹腔注射等体积生理盐水。4)VCD致POI模型方案:48只大鼠被随机分为3组。给予VCD实验组每天腹腔注射VCD(80mg/kg)连续14天,同时每天给予对照组(生理盐水组、蓖麻油组)腹腔分别注射等体积生理盐水和蓖麻油。用药后观察大鼠的一般情况、动情周期、体重等,用药开始后4周检测大鼠性激素水平,处死每组中的10只大鼠,观察卵巢病理及计数各级卵泡数目,观察心、肝、脾、肺、肾、脑脏器指数及病理变化。另外6只雌大鼠与雄鼠按照3:2进行合笼实验,观察6个月的妊娠情况。(3)h AD-MSC移植治疗SD大鼠POI体内实验:将体重在240-260g且具有正常动情周期的48只SD大鼠分为4组,即正常对照组、POI组、h AD-MSC(尾静脉)组和h AD-MSC(原位)组。对POI组、h AD-MSC(尾静脉)组和h AD-MSC(原位)组分别建立POI模型,同时对照组腹腔注射等量的生理盐水和蓖麻油。模型建立后24小时,对h AD-MSC(尾静脉)组经尾静脉注射0.5ml PBS细胞悬液(含有4×106个h AD-MSC),同时卵巢原位移植0.05ml(每侧卵巢0.025ml)PBS;对h AD-MSC(原位)组经尾静脉注射0.5ml PBS,同时卵巢原位移植0.05ml PBS细胞悬液(含有4×106个h AD-MSC,每侧卵巢0.025ml);对模型组和对照组经尾静脉注射0.5ml PBS,同时卵巢原位移植0.05ml PBS(每侧卵巢0.025ml)。h AD-MSC移植后,观察大鼠的一般情况、称重、阴道分泌物涂片等。移植4周后,检测大鼠性激素水平,处死所有大鼠,荧光信号追踪h AD-MSC在大鼠体内的归巢情况,卵巢各级卵泡数目等。(4)h AD-MSC原位移植治疗POI的机制探讨:将POI组和h AD-MSC(原位)组的卵巢进行蛋白芯片检测,检测卵巢局部蛋白表达谱的变化,对变化差值较大的前3个蛋白进行Western blot验证。结果:(1)h AD-MSC成功从人羊膜中分离和培养,贴壁生长,呈旋涡状排列,具有三向分化的能力,能够进行传代培养,保持细胞形态一致。(2)通过顺铂、环磷酰胺联合白消安、环磷酰胺、VCD建立大鼠POI模型,各方案均降低大鼠的正常动情周期、AMH水平、卵巢原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡、成熟卵泡数目。环磷酰胺联合白消安同时降低E2水平、提高FSH水平、降低生育率更优,且其他脏器外观及病理未见异常。(3)h AD-MSC原位和尾静脉移植组大鼠的动情周期比例增高,体重增加、AMH水平升高,卵巢卵泡数量增加。h AD-MSC(原位)组卵巢荧光信号分布比h AD-MSC(尾静脉)更强,E2水平较模型组明显增高。(4)h AD-MSC卵巢原位移植后,卵巢组织中的JNK2、p38、Serpin E1、Akt、MKK3/6、RSK1、MMP等蛋白表达增加。结论:(1)人羊膜间充质干细胞成功从人羊膜组织中进行分离和培养,具有三向分化的能力和间充质干细胞的特点。(2)通过环磷酰胺联合白消安、VCD、顺铂和环磷酰胺单用建立大鼠POI模型,4种方案均可成功建立SD大鼠的POI模型。环磷酰胺联合白消安在4个方案里能更好的诱导POI模型且副反应小,选择环磷酰胺联合白消安诱导POI模型进行下一步研究。(3)h AD-MSC卵巢原位移植和尾静脉移植都可以改善POI大鼠的卵巢功能,原位移植后,h AD-MSC到达卵巢组织的细胞更多,升高POI大鼠的E2水平效果更好。(4)h AD-MSC分泌细胞因子,可能通过MAPK信号通路和血管生成通路,上调卵巢局部的JNK2、p38、Serpin E1、Akt、MKK3/6、RSK1、MMP等蛋白,促进细胞的增殖和基因表达,修复卵巢功能。