建立兔椎间盘器官体外培养系统观察髓核组织和细胞的生物学特性

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目的:体外培养兔整体椎间盘器官包括上下椎体骨质、上下软骨终板、纤维环及髓核组织,观察髓核组织和细胞生物学特性,探索体外培养椎间盘器官建立椎间盘退行性变模型的可行性。方法:分离兔带骨质软骨终板的椎间盘器官,采用等渗透压培养基培养。观察组织膨胀程度、在0d(新鲜)、7d、14d用组织切片HE染色观察组织结构、透射电镜观测髓核细胞核、CCK-8试剂盒检测髓核细胞活性、TUNEL检测髓核细胞凋亡、RT-PCR技术检测髓核组织聚集蛋白聚糖及Ⅱ型胶原mRNA的表达情况。结果:1、培养72h后,组织膨胀趋于稳定,组织重量增加约为18.0%,培养1-4h间,组织膨胀速度最快,随后68小时,缓慢连续增加;2、培养14d后,椎间盘大体结构仍得以维持,椎间盘解剖结构清楚。14d时,髓核细胞外基质降解较7d明显,髓核数量细胞明显较7d减少,从0d-14d表现为渐进退变过程;3、CCK-8试剂盒检测发现7d时髓核细胞活性率为54%±9%,14d为22%±5%,7d与14d细胞活性比较有统计学差异(P<0.05);4、透射电镜发现:14d时,髓核细胞核较7d时明显皱缩,细胞基质降解亦明显,提示细胞凋亡;5、TUNEL凋亡检测发现:14d髓核细胞凋亡率为44.97%±16.45%较新鲜髓核细胞5.71%±6.52%增加,差异有统计学意义(P<0.05);6、RT-PCR检测发现:蛋白聚糖与Ⅱ型胶原mRNA表达均随培养时间增加而表达下降,下降均有统计学差异(P<0.05)。结论:体外等渗透液条件下培养的兔带骨质终板椎间盘器官具有可行性,2w内椎间盘整体性仍保持良好;细胞学或分子生物学分析发现,椎间盘组织培养14天,髓核细胞仍然具有活性和功能,但随着时间延长逐渐退变;椎间盘组织培养可以用来模拟快速椎间盘退变,并可进一步研究与退变相关的外界因素或退变修复。
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