PRKAA1属于AMPK家族中的一员,是生物体内一种重要的蛋白激酶,在能量稳态、脂肪代谢和细胞增殖中具有重要调控作用;LncRNA在生物体胚胎发育、脂肪沉积和细胞分化等过程中发挥重要的作用。本研究用贵州从江香猪和大白猪为研究材料,通过qRT-PCR、分子克隆、细胞培养、细胞转染、Western blot等技术,筛选和鉴定PRKAA1相关LncRNA-ALNC1和ALNC2基因,检测脂肪相关基因的表达水平,分析其在肌内、皮下脂肪前体细胞和脂肪细胞分化中的调控机制,探讨影响地方猪优质肉品性状成因,解析LncRNA对猪脂肪沉积和肉质性状的影响,对深入了解我国地方猪优质肉品性状,挖掘、保存和创新利用地方猪种资源等方面都具有重要的科学意义和潜在的应用前景。1.猪PRKAA1基因相关LncRNAs的筛选鉴定及其在组织中的表达分析通过在线软件NCBI和NONCODE(http://www.noncode.org/)对PRKAA1相关LncRNA进行筛选鉴定。结果成功筛选出PRKAA1基因相关LncRNAs(NONSUST030689.1,ALNC1)和(NONSUST004358.1,ALNC2)。序列分析显示:ALNC1全长935 bp,位于17号染色体,ALNC2全长1639 bp,位于11号染色体,克隆序列比原序列插入46 bp,二者具有丰富的二级结构和多个开放阅读框,与PRKAA1存在作用靶点,与miR-1226-5p、miR-487b-5p、miR-7156-5p等存在相互作用。组织qRT-PCR结果显示:ALNC1在从江香猪和大白猪的肝脏和大肠中的表达量最高,从江香猪脂肪和背最长肌组织中的表达量极显著高于大白猪(P<0.01),ALNC2在从江香猪和大白猪脾脏和肺脏中表达量最高,从江香猪脂肪的表达量显著低于大白猪(P<0.05),背最长肌表达量极显著高于大白猪(P<0.01)。推测两LncRNA可能是影响猪脂肪沉积的重要候选基因。2.ALNC1和ALNC2在原代脂肪前体细胞诱导分化过程中的表达分析分离并培养5日龄从江香猪原代肌内、皮下脂肪前体细胞。qRT-PCR方法检测两LncRNA和PRKAA1在细胞诱导0 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、96 h和120 h时间点的表达量。结果显示:肌内脂肪前体细胞中,PRKAA1和ALNC1两基因的表达趋势一致,先上升后下降,60 h表达最高;ALNC2在72 h表达最高;皮下脂肪前体细胞中,PRKAA1基因表达趋势与肌内前体细胞中一致,48 h表达最高;ALNC1与ALNC2两基因表现出相同的表达趋势,均先下降后上升再下降,72 h时表达最高。PRKAA1、ALNC1和ALNC2与脂肪分化相关基因PPARγ、FAS、ACC与ATGL在从江香猪原代脂肪前体细胞分化过程中的表达模式基本一致,表明ALNC1和ALNC2参与脂肪前体细胞的分化调控作用。3.ALNC1和ALNC2在前体脂肪细胞分化中的功能研究构建真核表达载体pEGFP-ALNC1和pEGFP-ALNC2,并合成针对ALNC1的siRNA,转染脂肪前体细胞后利用qRT-PCR和Western bloting技术检测脂肪代谢相关基因PRKAA1、PPARγ、FAS和HSL在mRNA和蛋白水平的表达,同时测定脂肪前体细胞中甘油三酯和胆固醇的含量。结果显示:过表达ALNC1后,肌内脂肪前体细胞中PRKAA1、FAS的mRNA和蛋白水平表达上调,PPARγ蛋白表达下调;皮下脂肪前体细胞中PRKAA1、PPARγmRNA和蛋白水平表达上调,HSL和FAS mRNA表达下调;干扰ALNC1后,肌内脂肪前体细胞中PRKAA1、FAS和HSL mRNA和蛋白水平表达下调,PPARγmRNA表达上调;皮下脂肪前体细胞中PRKAA1和HSL mRNA和蛋白表达下调,PPARγ蛋白表达上调。过表达ALNC2后,肌内脂肪前体细胞中PRKAA1、FAS和PPARγmRNA和蛋白水平上调,HSL的蛋白表达下调;皮下脂肪前体细胞中PRKAA1和HSL mRNA和蛋白水平上调,FAS mRNA水平下调,PPARγ蛋白水平下调。超表达ALNC1、ALNC2和干扰ALNC1后分别提高和降低了两前体脂肪细胞中甘油三酯和胆固醇的含量。综上所述,本文筛选得到两条与猪PRKAA1基因相关的LncRNA ALNC1和ALNC2,两条LncRNA在从江香猪和大白猪不同组织中普遍表达,从江香猪肝脏中的ALNC2的克隆序列比原序列插入了46 bp,可能作为从江香猪育种选育的分子标记片段;PRKAA1和ALNC1和ALNC2与脂肪分化相关基因在原代脂肪前体细胞分化过程中的表达模式基本一致,均先上升后下降;猪脂肪前体细胞中,ALNC1和ALNC2对细胞分化相关基因PRKAA1、FAS、PPARγ和HSL存在调控作用,促进了脂肪前体细胞的分化和脂肪的形成。