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目的:目前我国的器官移植数量位居世界第二,环孢素(Cyclosporine A,CsA)在器官移植领域中是最常用的免疫抑制剂之一。如何提高患者的生存率和移植物的存活率、减少肝损伤发生率、提高该药临床应用安全性,避免有害的相互作用现今已成为全球研究的热点问题。因此,研究移植手术后CsA致肝损伤的相关危险因素,对临床用药具有重大意义。结合本课题组的前期研究基础,探讨PXR-MRP2通路在环孢素所致药物性肝损伤中的作用机制。本课题利用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术,构建MRP2基因沉默的细胞株;利用课题组前期建立的CsA致HepG2细胞肝损伤模型,结合构建成功的沉默细胞株,给与不同浓度CsA,考察CsA对HepG2正常细胞、MRP2沉默细胞、PXR沉默细胞三组细胞的相关生化指标及MRP2、PXR蛋白表达和mRNA的影响,在细胞水平探究CsA是否通过PXR信号通路调控MRP2的表达及初步阐明MRP2在CsA致肝损伤中的作用,为临床用药提供理论基础和实验依据。方法:1.以带Puro抗性基因的pHBLV质粒为载体,人工合成MRP2-shRNA序列,pHBLV质粒进行酶切,胶回收与退火MRP2-shRNA序列连接,导入感受态细胞,进行筛选,测序。2.HepG2细胞进行预实验,筛选出适宜的嘌呤霉素浓度;采用三质粒包装系统,对293T细胞进行转染,得到携带目的shRNA片段的慢病毒去感染HepG2细胞,将重组质粒整合到HepG2细胞的基因组中,将带Puro抗性基因的pHBLV质粒,用嘌呤霉素对其进行筛选,从而得到转染成功的细胞,并进行western blotting实验。3.利用课题组前期建立的CsA致HepG2细胞肝损伤模型和课题组前期构建的PXR沉默细胞株,结合构建成功的MRP2沉默细胞株,给与不同浓度CsA,考察CsA对HepG2正常细胞、MRP2沉默细胞、PXR沉默细胞的相关生化指标及MRP2、PXR蛋白表达和mRNA的影响,在细胞水平探究CsA是否通过PXR信号通路调控MRP2的表达及初步阐明CsA影响MRP2表达的作用机制。结果:1.对MRP2-shRNA重组质粒进行测序,测序结果未见碱基突变,表明pHBLV-MRP2-shRNA重组质粒构建成功。2.对比MRP2沉默组与HepG2组,MRP2沉默组细胞MRP2的蛋白表达显著降低(P<0.05)具有统计学意义,成功构建了MRP2沉默细胞株,western blotting检测结果表明MRP2沉默细胞株的MRP2沉默效效率约为50%,PXR沉默细胞株的PXR沉默效效率约为55%。3.MRP2、PXR是CsA所致HepG2细胞肝损伤的相关基因,两者基因的表达下降,会明显升高肝功能指标AST、LDH值,使CsA所致HepG2细胞肝损伤更严重,当MRP2基因低表达时,低浓度的CsA就会引起AST和LDH值升高。4.在HepG2细胞和PXR沉默细胞中,两组细胞的MRP2蛋白表达随着CsA浓度增大而降低,与HepG2组比较,PXR沉默组MRP2蛋白表达均低于HepG2组(P<0.05、P<0.01)。5.在HepG2细胞和PXR沉默细胞中,两组细胞的MRP2 mRNA表达随着CsA浓度增大而降低,与HepG2组比较,PXR沉默组MRP2 mRNA表达均低于HepG2组(P<0.05)。结论:成功构建了带Puro抗性的pHBLV-MRP2-shRNA慢病毒表达质粒及MRP2沉默细胞株;MRP2、PXR是CsA所致HepG2细胞肝损伤的相关基因,加剧了CsA所致HepG2细胞肝损伤;对比CsA对HepG2细胞和PXR沉默细胞的影响,发现CsA对两组细胞的MRP2的mRNA和蛋白表达均有抑制作用,并且随着CsA浓度的增大抑制作用越明显;同时发现CsA对PXR沉默细胞的MRP2的mRNA和蛋白表达抑制作用显著低于HepG2细胞,说明PXR基因的沉默可显著降低CsA对MRP2的抑制作用。从而证实CsA可以通过PXR核受体来调控MRP2 mRNA和蛋白水平的表达。