三疣梭子蟹精子顶体反应、活力评价和保存的研究

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三疣梭子蟹[Portunus trituberculatus(Miers)],俗称枪蟹,隶属于甲壳纲、十足目、爬行亚目、短尾族、梭子蟹科、梭子蟹属。本文对其精子顶体反应、活力评价及保存进行研究,一方面为弄清其受精机制,丰富其受精生物学理论,为将来更深入的研究奠定基础,另一方面希望能在生产上对蟹类人工受精,遗传育种等工作有所启发、指导。 用离子载体A23187诱导三疣梭子蟹精子的顶体反应,获得75.33﹪的顶体反应率。应用光镜和电镜技术观察了顶体反应前后精子形态和结构的变化。未处理的精子呈陀螺形,由顶体、核杯和5~10条核辐射臂组成。顶体包括顶体囊和顶体管。顶体囊的伞形头帽拥有约70条辐射肋。连续发生的精子顶体反应过程被人为地分为四个阶段:(1)头帽鼓起;(2)顶体囊外翻;(3)穿孔器前伸,顶体囊膜翻转;(4)顶体囊膜脱落,顶体丝形成。直到第四阶段才观察到钉状精子的辐射臂开始收缩。本文还探讨了辐射臂和穿孔器前冲在精子入卵中的功能。 对三疣梭子蟹输精细管和纳精囊精子在不同月份的顶体反应率进行了比较。在光学显微镜和扫描电子显微镜下观察发现,输精细管内获取的精子在形态上与纳精囊内取出的精子是一样的。使用离子载体A23187人工诱导两种不同来源精子的顶体反应,结果显示:输精细管内精子的校正顶体反应率并不稳定,最高值55.97﹪出现在10月末,最低值17.37﹪出现在12月初。雌蟹纳精囊内精子的校正顶体反应率同样不稳定,最高值96.35﹪出现在6月初,最低值60.25﹪和76.39﹪分别出现在11月初和6月末。纳精囊内精子的校正顶体反应率极显著高于输精细管内精子的校正顶体反应率(P<0.01)。 采用染色法和钙离子载体A23187诱导精子顶体反应法对三疣梭子蟹精子的活力进行评价研究。染色实验结果表明,采用台盼蓝染色液无法清晰辨别死、活精子。采用伊红染色法处理的死、活精子分别呈现不同的染色特征:活精子无色,顶体中央突起呈圆锥状,光学显微镜下可见辐射臂,细胞边界清晰可辨;死精子核杯、顶体均着色,细胞边界有稍许模糊。最适合的染色剂浓度、染色时间和温度分别为2﹪、2~3min和4~37℃。钙离子载体A23187诱导精子顶体反应的结果显示:在诱导时间、浓度分别达到50min、30μg/ml时,校正顶体反应率达到92.73±2.43﹪。对以上两种活力检测方法进行比较分析,结果显示:伊红染色法与诱导顶体反应法的检测结果均与理论值极显著正相关(P<0.01),二者之间亦呈极显著正相关(P<0.01),说明两种方法均可用于精子活力检测,其结果具可比性。 于2003年9月到2004年7月对三疣梭子蟹精子进行了常温、低温和超低温保存研究。利用离子载体A23187人工诱导顶体反应以判断精子活力。常温和低温保存实验的结果显示,4℃下无钙人工海水保存5天,成活率达到40﹪以上。在两种温度(4℃、25℃)与两种基础液(无钙人工海水、天然海水)的4种组合中,最优组为4℃、Ca++ FASW,最差组为25℃、NSW。将精子浓度与Ca++ FASW对照组、诱导组及校正顶体反应率比较,结果显示:25℃和4℃下浓度与对照组顶体反应率相关性均不显著(P=0.068>0.05,P=0.265>0.05);25℃和4℃下浓度与诱导组顶体反应率均极显著相关(P<0.01)。以二甲亚砜和甘油作为抗冻剂进行超低温冷冻实验。72小时后取出,解冻后包括对照组在内的所有精子98﹪以上不经诱导就能发生顶体反应。
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