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三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)是我国重要的海产养殖蟹类,但近年来养殖病害频发,致使蟹类养殖业经济损失严重。副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)和白斑综合症病毒(WSSV)是导致三疣梭子蟹病害频发的主要病原。研究发现,细胞凋亡可参与机体的免疫应答反应。但有关细胞凋亡在三疣梭子蟹病原感染中的作用机制尚不清楚。本论文主要对三疣梭子蟹相关凋亡基因在病原感染过程中的功能进行了研究分析,研究结果不仅可以为三疣梭子蟹在病害防治中提供一种新的研究思路,也可以进一步丰富细胞凋亡在甲壳类免疫防御中的作用提供实验数据和参考。本研究采用RACE(rapid amplification of cDNA ends)技术,从三疣梭子蟹首次克隆得到Pt JNK、PtBcl-2、PtBax相关凋亡基因的cDNA全长,同时采用实时荧光定量PCR和western blot检测了这些基因在各组织中的分布以及在副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)和对虾白斑综合症病毒(WSSV)病原胁迫后的表达模式,并利用荧光原杂交技术对其进行了功能定位,此外还通过ds RNA干扰技术和酵母双杂交技术对PtBax和PtBcl-2作用功能机制进行了分析。论文的主要研究结果如下:1.克隆了三疣梭子蟹JNK基因(Pt JNK)的cDNA全长3240 bp,开放阅读框1380bp,编码459个氨基酸,生物信息学分析显示,该氨基酸序列具有TPY磷酸化位点的S＿TKC保守结构域,属于JNK基因家族典型结构特征,无信号肽及跨膜结构域,并且在进化上具有高度的保守性。利用q RT-PCR技术检测了三疣梭子蟹Pt JNK基因在不同组织的表达模式,发现Pt JNK在各组织中都有表达,在肝胰腺中表达量最低,胃和肌肉中的表达量最高(与肝胰腺的表达水平相比分别为3.98倍和3.78倍),推测Pt JNK可能在三疣梭子蟹中发挥不同的作用,其作用因组织类型的不同而不同。副溶血弧菌感染三疣梭子蟹后,检测Pt JNK基因在血细胞、鳃和肝胰腺3个组织中的相对表达量,结果显示:与对照组相比基本呈现不同程度的下调趋势,且呈现先下降后上升再下降后趋于平衡的表达模式。而注射WSSV后,Pt JNK基因在血细胞、肝胰腺和鳃3个组织中,相对对照组呈上调表达。结果表明,Pt JNK基因是一种广泛表达基因,且在不同的病原感染情况下,该基因的表达模式存在着差异,在免疫防御过程中具有重要作用。2.克隆了三疣梭子蟹PtBax和PtBcl-2基因cDNA序列全长,PtBax cDNA全长为2571bp,ORF1512bp,共编码503个氨基酸;PtBax cDNA全长为2015bp,ORF 867bp,共编码288个氨基酸,推导出的氨基酸序列中均具有Bcl-2基因家族典型的Bcl相关蛋白结构域。全组织定量结果显示,这两个基因在各组织中均广泛表达,均在肝胰腺中表达水平最高;副溶血弧菌和WSSV病原感染后,PtBax和PtBcl-2在三疣梭子蟹肝胰腺中的m RNA和蛋白水平均显著上调;荧光原位杂交结果显示,PtBax和PtBcl-2主要表达于细胞质中,在病原菌感染后,两个基因在细胞膜上高度表达。用ds RNA分别对三疣梭子蟹的PtBax和PtBcl-2基因进行敲降后再用副溶血弧菌和WSSV感染三疣梭子蟹,发现由病原引起的三疣梭子蟹死亡率显著增加,但WSSV拷贝数具有明显差异,PtBax基因敲降后WSSV拷贝数明显减少,PtBcl-2基因敲降后WSSV拷贝数显著增加,说明了PtBax和PtBcl-2基因在病原菌感染过程中具有重要的免疫作用。3.从转录水平和蛋白水平上研究了三疣梭子蟹PtBax和PtBcl-2之间的作用关系。当对三疣梭子蟹PtBax基因沉默后,三疣梭子蟹PtBcl-2表达量出现上调表达;当对三疣梭子蟹PtBcl-2基因沉默后,三疣梭子蟹PtBax表达量出现上调表达,这说明了PtBax和PtBcl-2是一对相互拮抗的凋亡调控基因。并通过酵母双杂交实验进一步验证了PtBax和PtBcl-2的相互作用关系,其结果说明PtBax可通过与PtBcl-2结合参与病原感染三疣梭子蟹的免疫过程。