研究目的本课题在肺与大肠相表里理论指导下,在溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)肠黏膜屏障功能热点研究环境下,创新性提出UC“毒损肠络”及UC肺损伤“毒损肠络,毒邪上攻损肺”病机学说,并通过实验观察UC模型大鼠肠黏膜紧密连接蛋白表达、通透性及肺组织紧密连接蛋白、炎性细胞因子、氧自由基表达的变化,探讨UC肺损伤病理机制,以期从微观上找到新的肺肠相关的物质支持,为病机假说提供实验依据。同时阐明中药单体苦参碱、黄芪多糖(APS)及二者合用对UC及UC肺损伤的作用途径及靶点,进一步论证与深化肺与大肠相表里理论,为临床解决UC及UC肺损伤这一医学难题提供新的治疗思路及有效药物。研究方法将120只健康雄性Wistar大鼠采用结肠黏膜组织致敏与三硝基苯磺酸-乙醇灌肠相结合的免疫复合法复制大鼠UC模型,另30只设为正常对照组。大鼠造模灌肠后第3d(Ow),随机选取正常组和模型组大鼠各10只,杀检取材,检验造模是否成功。剩余110只模型大鼠随机分为五组,即模型组、西药对照组、苦参碱治疗组、APS治疗组、单体混合组。治疗组于灌肠后第3d开始灌胃给药,均配成水溶液后按60kg体重成年人药量的8倍计算灌胃剂量,单体混合组将APS和苦参碱按照1：1比例混合配成溶液；正常组、模型组用等体积饮用水灌胃,每日1次。每日观察各组大鼠一般状态变化,于给药0w、2w、4w时称重,麻醉后腹主动脉取血处死,并取肺、肠组织进行相关指标检测。研究结果1.UC模型大鼠一般状态、体重的变化及中药单体的影响UC模型大鼠一般生活状态差,0w、2w、4w时与同期正常组比较体重均明显降低(P<0.05或P<0.01),DAI评分升高(P<0.01),并有呼吸气急、喘促等肺部症状。各中药单体治疗组大鼠一般生活状态及肺部症状较模型组改善。2w时,苦参碱治疗组和单体混合组大鼠DAI评分与同期模型组比较降低(P<0.05),4w时单体混合组大鼠DAI评分显著低于模型组(P<0.05);APS治疗组及中药单体混合组大鼠体重增长较快,与同期正常组比较无显著性差异。2.UC模型大鼠肺肠组织病理形态学变化及中药单体的影响HE染色病理形态学观察结果：UC模型大鼠结肠黏膜有充血、水肿、糜烂、溃疡、坏死及血管炎表现,2w时未见明显改善,4w时较前有所改善,以慢性溃疡性炎症为主,有肉芽组织增生。肺间质炎性细胞浸润,间质充血、水肿、微血管炎可见于UC各个时期,4w时肺纤维化表现明显。中药单体能有效减轻UC肺肠组织病理形态学改变。3.UC模型大鼠肠黏膜大体形态学损伤、肠黏膜通透性变化及中药单体的影响肉眼观察行结肠黏膜大体形态学损伤评分(CMDI);ELISA方法检测大鼠血清ET水平;分光光度法检测大鼠血清DAO活性。结果：UC大鼠结肠短缩,与周围组织粘连严重,结肠袋消失,近端结肠扩张,肠壁变薄质脆,或肠壁增厚,肠腔变窄。结肠黏膜充血,糜烂、溃疡形成,基本结构消失,血管纹理模糊。2w和4w时CMDI评分均显著高于同期正常组(P<0.01)。0w、2w、4w模型组大鼠血清ET含量及DAO活性增高,与正常组比较差异显著(P<0.05或P<0.01)。苦参碱及单体混合组肠黏膜损伤程度减轻,CMDI评分与同期模型组比较差异显著(P<0.05);血清ET和DAO水平均明显降低(P<0.05或P<0.01),肠黏膜高通透性改善。4.UC模型大鼠肠黏膜紧密连接相关蛋白ZO-1、Occludin表达的变化及中药单体的影响Western-blot法测定ZO-1在UC大鼠肠黏膜中的表达,免疫组化法观察Occludin蛋白在肠黏膜中的分布与表达。结果：与正常组比较,UC模型组大鼠肠黏膜ZO-1和Occludin蛋白表达明显降低(P<0.05或P<0.01)。2w时,各治疗组大鼠肠黏膜ZO-1和Occludin蛋白表达均有所增加,但差异没有统计学意义;4w时与同期模型组比较,单体混合组ZO-1和Occludin蛋白表达显著高于同期模型组(P<0.05或P<0.01),APS(?)疗组Occludin蛋白表达亦明显升高(P<0.05)。5.UC模型大鼠肺组织中紧密连接相关蛋白ZO-1、Occludin表达的变化及中药单体的影响Western-blot去测定紧密连接蛋白ZO-1在UC大鼠肺组织中的表达,免疫组化法观察Occludin蛋白在肺组织中的分布与表达。结果：与正常组比较,UC模型组大鼠肺组织中ZO-1和Occludin蛋白表达明显降低(P<0.05或P<0.01)。2w和4w时,各治疗组肺组织中ZO-1蛋白表达均有所增加,2w时单体混合组ZO-1和Occludin蛋白表达显著高于同期模型组(P<0.05),4w时APS治疗组ZO-1表达OD值明显高于正常组和模型组,但各组间比较差异无统计学意义；APS治疗组及单体混合组大鼠肺组织Occludin蛋白表达与同期模型组比较显著上调(P<0.05)。6.UC模型大鼠肺组织中炎性细胞因子和氧自由基表达的变化及中药单体的影响ELISA法测定UC大鼠肺组织中TNF-α、IL-1β含量,化学比色法测定大鼠肺组织匀浆中SOD、MDA及MPO活性。结果：2w和4w时,UC模型大鼠肺组织匀浆中TNF-α、IL-1β、MDA、MPO水平增高,SOD活力明显下降(P<0.05或P<0.01)。中药单体能够增强UC大鼠肺组织抗炎及清除氧自由基的能力,减轻脂质过氧化程度。7.中药单体对UC大鼠肺肠组织中TFF3表达的影响免疫组化法观察TFF3在UC大鼠肺肠组织中的分布与表达。结果：与正常组相比,2w和4w时UC模型组大鼠肠组织中TFF3表达均明显减少(P<0.05),单体混合组TFF3表达较同期模型组均显著升高(P<0.05);各时间点、各组大鼠肺组织TFF3表达比较没有统计学意义(P>0.05)。结论1.免疫复合法复制的大鼠UC模型,体现了肠黏膜屏障损害与免疫调节失衡这两个UC最主要的致病因素,是研究UC发病机制及药物治疗的理想模型。2.“毒损肠络,毒邪上攻损肺”是UC肺损伤的根本病机,可能为UC迁延不愈、反复发作的重要原因。3.UC大鼠肺肠组织病理改变说明UC湿热瘀毒上扰,肺气不利,肺肠同病。4.UC大鼠肠黏膜ZO-1和Occludin表达下降,通透性增高,肠黏膜屏障损伤,是UC"毒损肠络”病机的生物学基础。5.UC大鼠肺组织ZO-1和Occludin表达下降,屏障结构受损,是UC"毒损肠络,毒邪上攻损肺”病机的生物学基础。6.UC大鼠肺组织中异常表达的炎性细胞因子和氧自由基是“肺与大肠相表里”的共同物质基础,是导致UC及UC肺损伤的内生之“毒’7.中药单体苦参碱、APS及两单体混合能够改善UC大鼠生存状况,减轻肺肠组织病理形态学改变。8.中药单体苦参碱、APS及两单体混合对UC肺损伤有保护作用,可能是通过增加肺肠组织ZO-1和Occludin表达,修复受损的肺肠屏障,增强肺组织抗炎及清除氧自由基能力,上调肺肠组织修复因子表达实现的。