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目的:我们在前期研究工作中,应用P糖蛋白(P-glycoprotein)特异性抗体检测出大鼠胰岛β细胞中存在65kDa大小的膜蛋白,我们称之为mini P糖蛋白或者小P糖蛋白,借助膜片钳技术我们发现此蛋白有类似磺脲类受体的功能,可促进胰岛素颗粒释放,而经典的P糖蛋白(也称多药耐药蛋白1,Multidrug Resistance Protein1,MDR1)则是发挥外排泵的功能,不具有磺脲类受体的功能,所以这65kDa大小的miniP糖蛋白是转录水平上MDR1基因的选择性剪切产生的还是由于蛋白酶解作用而生成的降解产物值得更进一步的加以证实。本研究通过应用实时荧光定量技术(FQ-PCR)以及northern blot在mRNA水平上分析大鼠胰岛编码P糖蛋白的abcb1b基因的表达情况,对miniP糖蛋白的存在进行初步探测。方法:一、大鼠P糖蛋白生物信息学研究:(1)P糖蛋白理化性质的分析。(2)P糖蛋白保守序列分析。(3)P糖蛋白两个保守序列三维结构的比较。(4)P糖蛋白亲水性的预测。二、实时荧光定量PCR检测abcb1b基因N端、C端以及abcb1a基因的绝对表达量:(1)经胆管不离体灌注胶原酶V消化分离Wistar大鼠胰岛,INS-1细胞培养。分别提取大鼠胰岛、INS-1细胞、肝脏等组织的总RNA,针对MDR1特异基因序列abcb1b的3’末端及5’末端设计N端引物和C端引物,并针对啮齿类动物P糖蛋白的另一个调控基因abcb1a设计引物,进行逆转录PCR,合成对应的cDNA(2)上述PCR回收产物纯化、转化、克隆以及质粒提取。(3)FQ-PCR中标准曲线的制作:分别针对N端、C端、abcb1a制作三条标准曲线。(4)按上述制作标准曲线的反应体系和反应条件来检测标本(胰岛)的表达量,每次检测时均带标准曲线,阳性对照(肝脏,INS-1细胞,肾,脑),计算其拷贝数。(5)应用统计学方法分析结果。三、Northernblot检测大鼠胰岛abcb1b基因的选择性剪切:(1)INS-1细胞培养,提取INS-1细胞的总RNA,针对MDR1特异基因序列abcblb的3’末端及5’1末端设计引物,进行逆转录PCR,合成对应的cDNA。(2)上述PCR产物应用罗氏地高辛试剂盒(DIG DNA Labeling and Detection Kit)进行随机引物DNA标记作为探针以供后续进行northern blot。(3)经胆管不离体灌注胶原酶V消化分离Wistar大鼠胰岛,提取大鼠胰岛的总RNA,然后进行RNA甲醛变性电泳分离RNA,接着利用虹吸印迹法转膜至尼龙膜。(4)在合适的杂交温度下,用上述探针与尼龙膜上的RNA进行杂交,免疫检测。结果一、大鼠P糖蛋白生物信息学研究结果:P糖蛋白由1275个氨基酸组成,相对分子量为140655.2;P糖蛋白有2个相似保守序列,同源性达46%,N端有10-15kDa区域为糖基化区(非功能区);P糖蛋白为疏水蛋白。二、FQ-PCR检测abcb1b基因N端、C端以及abcb1a基因的绝对表达量:(1)大鼠胰岛abcb1b的N端标本拷贝数为:(26.29±13.67)×104;C端拷贝数为(43.42± 10.72)×104;abcb1a标本的拷贝数为(9.23±0.09)× 104.。(2)不同的组织或细胞中,abbcb1b的表达量比较结果是INS-1细胞>胰岛>肝脏>肾脏>脑。(3)不同的组织或细胞中,abcb1a的表达量比较结果是肝脏>胰岛>脑>INS-1细胞>肾脏。三、Northern blot检测大鼠胰岛abcb1b基因的选择性剪切:(1)以大鼠abcb1b基因序列的3’末端及5’末端设计引物,以INS-1细胞的总RNA逆转的cDNA为模板,合成了 673bp的片段,用地高辛标记,标记效率测定显示探针标记成功。(2)northern杂交结果空白,斑点杂交结果证实探针与胰岛RNA可杂交。结论(1)大鼠胰岛中abbcb1b的表达量大于abcb1a,约5倍左右,由于前期研究表明大鼠胰岛a细胞几乎不表达P糖蛋白,故表明胰岛β细胞P糖蛋白的生物功能主要是由abcb1b调控。(2)大鼠不同组织或细胞P糖蛋白的主要调控基因不同:INS-1细胞、肝脏P糖蛋白的调控基因主要是abcb1b;而在脑组织中主要是abcb1a,在肾脏中两种基因表达量相似。(3)大鼠胰岛abcb1bC端的表达量大于N端的表达量,约1.7倍左右,提示mini P糖蛋白是abbcb1b基因转录水平上选择性剪切而产生的可能性。mini P糖蛋白是基因表达的产物。(4)Northern bolt旨在观察胰岛RNA与探针杂交后出现条带的数目及大小,证实选择性剪切的存在。本实验探针标记成功,RNA转膜后与探针杂交未成功,但斑点杂交结果可判断探针与胰岛RNA有杂交。