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频繁发生的大豆疫霉根腐病,严重影响了大豆的产量。研究发现:(一)含NBS-LRR结构域的抗病蛋白可充当受体的角色识别激发子激发植物体内的防卫反应;(二)该类蛋白在植物细胞程序性死亡发育过程中具有重要的应用价值;(三)在拟南芥中有研究发现,该蛋白对病害的抗性为正向调控。本研究前期通过对大豆“吉农18”突变体“M18”苗期根系转录组测序筛选得到了差异表达Gm LNDR基因,并进一步探索该基因在大豆抗病中的具体作用机制及生物学功能。首先利用同源PCR技术(Homologous PCR)从“M18”苗期叶片基因组中克隆得到Gm LNDR基因;继而利用无缝克隆技术(Seamless cloning)分别构建了植物过表达载体p3301-Gm LNDR和植物RNAi干扰表达载体p3301-RNAi-Gm LNDR;通过农杆菌介导法和花粉管通道法将载体质粒转化到受体“JN18”;在接种大豆疫霉菌环境中,探索通过下胚轴侵染法开展的该基因在苗期“JN18”根、茎、叶中的表达;最后,对转基因后代进行检测和抗病性鉴定,验证该基因的功能。主要研究结果如下:1.目标基因的核酸序列结构分析表明:基因是以α螺旋结构为基础的稳定空间构象,大小为501bp,是亲水性蛋白;其与已知的拟南芥AT3G14460基因亲缘关系较近;通过同源PCR技术克隆了该基因,进而成功构建了克隆载体PMD-18T-Gm LNDR。2.植物表达载体的构建结构表明:正是以植物表达载体p CAMBIA3301为基础,利用无缝克隆技术构建了植物过表达载体p3301-Gm LNDR和植物干扰表达载体p3301-RNAi-Gm LNDR。3.遗传转化结果表明:通过农杆菌介导法和花粉管通道法,把构建成功的植物过表达载体p3301-Gm LNDR和植物RNAi干扰表达载体p3301-RNAi-Gm LNDR分别转入到大豆受体“JN18”中。4.转化株系的PCR检测结果表明:均出现与已知序列启动子35S、终止子Nos,和筛选标记Bar位置完全一致的特异性条带,这初步证明了目的基因Gm LNDR成功转入到大豆受体吉农18中。(1)通过农杆菌介导法得到TO代转Gm LNDR过表达载体基因植株7株,TO代转Gm LNDR干扰表达载体基因植株9株;(2)通过农杆菌介导法得到T1代转Gm LNDR过表达载体基因植株4株,T1代转Gm LNDR干扰载体基因植株4株;通过花粉管通道法得到T1代转Gm LNDR过表达载体基因植株2株,T1代转Gm LNDR干扰载体基因植株3株;(3)通过农杆菌介导法得到T2代转Gm LNDR过表达载体基因植株3株,T2代转Gm LNDR干扰载体基因植株3株;通过花粉管通道法得到T2代转Gm LNDR过表达载体基因植株3株,T2代转Gm LNDR干扰载体基因植株3株;5.以筛选标记Bar制取探针,T2代转基因阳性植株的Southern试验结果表明:转Gm LNDR过表达载体和转Gm LNDR干扰表达载体成功整合进大豆受体的基因组,且整合位点不同。6.T2代转基因植株的荧光定量PCR结果显示:转Gm LNDR过表达载体基因在大豆根、茎、叶中的表达量均高于受体CK,转Gm LNDR干扰表达载体基因在大豆根、茎、叶中的表达量均低于受体CK;两类表达中均呈现为,叶部表达量最高,其次为根,最少为茎;这说明转Gm LNDR过表达载体基因促进了大豆内源基因的表达,而转Gm LNDR干扰表达载体基因抑制了大豆内源基因的表达7.在转基因后代中,疫霉根腐病的抗性鉴定结果表明:“转过表达载体”植株接种疫霉菌的死亡率为22.22%,属抗性水平;受体“JN18”死亡率为48.14%,属中抗水平;“转干扰表达载体”植株接种疫霉菌的死亡率为70.37%,属感病水平;以上说明:该基因的表达水平高低,直接与大豆植株对疫霉菌的抗性相关。8.抗病性比较结果表明:转Gm LNDR过表达载体的植株接种疫霉根腐病的死亡率为22.22%,而转hrp Zpsta过表达载体的植株接种疫霉根腐病的死亡率为11.11%和18.51%;前者抗病能力仅低于具有广谱抗病性的后者,可能与Gm LNDR基因的功能有关。