【摘 要】
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肿瘤相关成纤维细胞（Cancer-associated Fibroblast,CAFs）作为肿瘤微环境的重要组分,可以通过分泌多种促肿瘤效应因子以旁分泌方式调控包括肿瘤生长、转移等生物学行为,已成为人们研究肿瘤治疗的一个新方向。目前,p53以及突变p53在CAFs激活中的作用目前尚不明确。p53N236S(纯合突变为p53S/S,人类中为p53N239S,以下简称p53S),是发生在p53第七号外
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肿瘤相关成纤维细胞（Cancer-associated Fibroblast,CAFs）作为肿瘤微环境的重要组分,可以通过分泌多种促肿瘤效应因子以旁分泌方式调控包括肿瘤生长、转移等生物学行为,已成为人们研究肿瘤治疗的一个新方向。目前,p53以及突变p53在CAFs激活中的作用目前尚不明确。p53N236S(纯合突变为p53S/S,人类中为p53N239S,以下简称p53S),是发生在p53第七号外显子上的一个错义点突变,表现为第七号外显子上第236位密码子由AAT突变为AGT。实验室前期数据显示:p53S/S小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）具有促进前列腺癌细胞PC-3生长、迁移和侵袭的CAFs特性。CAFs通常以a-SMA为标志物,具有较强的胶原收缩能力且分泌CAFs相关效应因子行使其促肿瘤功能。我们以WT、p53-/-和p53S/S MEFs细胞为材料,通过Western blotting检测细胞中a-SMA的表达水平。发现:p53S/SMEFs中高表达a-SMA。接下来的凝胶胶原收缩实验显示,p53S/SMEFs具有CAFs特有的胶原收缩能力。随后的ELISA实验同样显示p53S/SMEFs分泌CAFs效应因子CXCL12的能力增加。同时,p53S/S MEFs可以促进人非小细胞肺癌细胞H1299迁移和侵袭。以上数据提示:p53S促进CAFs特性的激活。为了进一步研究p53S调控CAFs特性激活的分子机制。对MEFs细胞进行Microarray芯片扫描和GSEA分析发现:p53S/SMEFs中IL6-JAK-STAT3通路激活。Western blotting结果也显示,p53S/SMEFs中,STAT3通路激活的标记物p-STAT3（Y705）的表达升高。阻断IL6-JAK-STAT3通路后,随着p-STAT3（Y705）蛋白表达量降低,α-SMA的蛋白水平随之降低,p53S/S MEF的胶原收缩能力降低,分泌CXCL12能力减弱,且p53S/S MEFs促进H1299迁移和侵袭的能力也随之降低。表明p53S通过IL6-JAK-STAT3通路激活CAFs特性。那么,p53S如何激活IL6-JAK-STAT3通路?ROS的累积是IL6-JAK-STAT3的激活剂。检测细胞中ROS的水平,发现p53S/SMEFs中ROS水平显著低于WT MEFs。同时,通过检测PGC-1a的蛋白表达量,同样发现p53S/SMEFs中PGC-1a的表达升高。提示,p53S并不通过累积的ROS激活IL6-JAK-STAT3通路。检测IL6-JAK-STAT3上下游基因蛋白的表达后发现,上游磷酸激酶p-JAK21007/1008蛋白水平升高,且磷酸酶SHP2蛋白表达无变化,初步推测p53S通过上调p-JAK21007/1008激活IL6-JAK-STAT3通路从而激活CAFs特性。研究过程中发现,WT MEFs连续传代至衰老过程中p-STAT3（Y705）和α-SMA蛋白表达量升高,胶原收缩能力升高,且分泌CXCL12的能力增强,表现出与p53S/SMEFs相似的CAFs特性。衰老过程中,p16表达水平升高,DNA损伤标志物r-H2AX升高和ROS的累积均可能激活STAT3通路,进而激活其CAFs特性。因此,检测了p16-/-MEFs中的p-STAT3（Y705）、α-SMA的表达水平,发现p16-/-MEFs同样高表达p-STAT3（Y705）、α-SMA,排除p16蛋白升高引起的IL6-JAK-STAT3通路激活。而p16-/-MEFs中高水平的r-H2AX可能促进STAT3通路的激活。通过DOX处理WT MEFs,发现随着r-H2AX表达升高,p-STAT3和a-SMA随之升高。然而,DNA损伤会引起ROS累积。因此,我们在Dox处理WT MEFs细胞的同时,利用NAC清除细胞中的ROS,发现p-STAT3（Y705）蛋白表达随之降低,表明成纤维细胞中,ROS的累积可以通过L6-JAK-STAT3通路激活其CAFS特性。综上所述,本研究表明p53S通过上调p-JAK21007/1008激活IL6-JAK-STAT3通路,进而激活CAFs特性;此外,成纤维细胞衰老过程中,ROS的累积同样通过IL6-JAK-STAT3通路,激活其CAFs特性。
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