近来研究表明：胰腺癌K-ras基因第12位密码子点突变在组织中检出率高达71％-100％，在胰液中高达67％-100％，在血浆中高达27％-81％，在十二指肠液中高达60.9％-66％；突变方式也几乎皆由野生型GGT突变为CGT、GTT及GAT三种类型，而正常胰腺组织、胰岛素瘤、胰腺良性囊肿及胰腺其他肿瘤均无K-ras基因突变，少有报告慢性胰腺炎存在低检出率K-ras基因突变。因此，检测K-ras基因有无突变，有助于胰腺肿块良恶性鉴别及胰腺癌的早期诊断。 检测胰腺癌K-ras基因第12位密码子点突变方法有：(1)PCR-RMCM，(2)PCR-ASOH，(3)PCR-SSCP，(4)PCR-RFLP，(5)PCR-DSM，及(6)PCR-MASA。我们根据K-ras基因序列，采用针对该密码子点突变方式(CGT、GTT、GAT)设计合成引物，自1994年来，率先在国内对胰腺癌石蜡包埋组织、冰冻新鲜组织、胰腺肿块细针穿刺组织及胰液标本采用PCR-MASA检测，K-ras基因突变率分别为74.2％(23／31)、95.1％(39／41)、91.4％(32／35)及94.1％(16／17)，无假阳性发生。该法与前5种方法比较具有：(1)简捷、特异、敏感，扩增产物只 南京医科大学博士学位论文需常规电泳、染色即可观察结果，从样品处理到结果报告只需5小时。（2）无需酶切、杂交、放射性和非放射性显影。（3卜临床易普及推广应用。在此基础上，从 19 9 9年起我们又开展了对胰腺癌病人外周血、腹水及十二指肠液标本的检测，K一 r a s基因突变率分别为 3 8．1％（8／21）、31．6％（6／19）、17．4％＊八3厂 而所有被检测的慢性胰腺炎、胰岛素瘤、壶腹癌、十二指肠乳头癌及胃癌、肝癌、胆石症病人外周血、腹水及十＝指肠液标本均无K1as基因突变。 大量文献报道胰腺癌存在K1as基因表达产物P川蛋白高表达，免疫组化检测阳性率达 61％一8 8．7％”‘一’‘’y‘，’‘，日‘’口 自 19 9 9年起，我们根据相关文献，采用针对 K1 a s基因表达的氨基酸序列合成多肽作为免疫原，制备单克隆抗体，应用免疫组化检 d，发现胰腺癌N 1蛋白 F日性表达率为 8 8．1％（3 7／4 2）。 在此基础上，我们使用自制单抗与化疗药物5－FU、表阿霉素、丝裂霉素、P］页铂，对胰腺癌h P C－3和仍 P C－1两株 iw 月包体外实验研究，噶哇蓝比色试验（PPP）显示 P21单抗、51、表阿霉素、丝裂霉素以及）烦铂随作用时间的延长和药物剂量（浓度）的增加；对胰腺癌BXPC刁和ASPC刁两株细胞抑制率逐渐增加，并显示PN单抗具有直接抗胰腺癌作用；单抗分别与上述化疗药物联合应用具有协同效应。 流式细胞仪检测（FCM）结果也显示P 21单抗具有直接使胰腺癌BXPC－3和ASPC－1两株细胞凋亡的作用，与5－FU、表］河霉素分别联合应用，可提高化疗药物对胰腺癌BXPC刁和A S P C－1两株细月 凋亡率。 胰腺癌是临床常见的恶性肿瘤之一，发病率逐年上升，早期诊断极为困难，手术切除率仅为 15《 0儿 预后极差；胰腺肿块术前定性时有困难，现行的各项检查尚不能完全满足临床诊断需要，上述系列研究表明：（1）采用K ＊MSA对细针穿刺组织、胰液、外周血、腹水及十二指肠液标本，检灿JK－ras基因第12位密码子有无突变，具有临床实用性，可有助 4 南京医科大学博士学位论文于判断胰腺病变良恶性及胰腺癌的诊断。对十二指肠液、腹水及外围血标本的检测，具有简便、无损伤、反复等优点，建立了更为方便的标本来源途径。（2）胰腺癌存在K1as基因表达产物P川蛋白高表达，P21单抗具有直接抗胰腺癌作用，与化疗药物联合使用可提高疗效。推测P21单抗可作为一种较理想的放免定位和免疫治疗载体。在单克隆抗体发展的基础上，可能建立起一种有效实用的治疗中晚期胰腺癌及其他肿瘤的新方法。