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吗啡(Morphine)作为经典的阿片类药物,在临床治疗急慢性疼痛,神经病理性疼痛和癌痛方面广泛应用。吗啡长期应用后产生耐受限制了药物在临床的应用,成为疼痛诊疗中的难题。这一问题引起学者广泛关注,从不同水平进行大量研究,但目前吗啡耐受的机制尚未完全阐明。吗啡耐受主要表现为镇痛作用减弱、持续时间缩短、停药后疼痛加剧及痛觉过敏,临床应用时需要给予更大剂量才能达到理想镇痛效果,而大剂量吗啡会加重药物的不良反应。吗啡耐受涉及主要机制为阿片受体脱敏、内化,以及与其他受体的异聚化,炎症反应,谷氨酸转运体下调,其他机制仍在不断探索中。吗啡耐受机制的研究对于临床疼痛治疗过程中安全用药有重大的意义。此外,有文献报道内质网上的分子伴侣结合免疫球蛋白BIP(binding immunoglobulin protein,or glucose-regulated protein 78,又称为BIP/GRP78)在吗啡耐受的发展中起重要作用,而BIP/GRP78在内质网应激(Endoplasmic Reticulum Stress,ER stress)的调控中发挥重要作用。有研究表明,内质网应激可以诱导NLRP3(NLR Family Pyrin Domain Containing 3)炎性小体(inflammasome)的激活,以及LCN2(Lipocalin-2)蛋白水平的增加。因此,本课题主要研究内质网应激诱导的NLRP3炎性小体的激活及LCN2的增加在吗啡镇痛耐受及吗啡诱导的痛敏中的作用及机制。目的:建立吗啡耐受大鼠模型,探讨大鼠脊髓L2-L6段背角内质网应激的发生及相关蛋白表达情况,IRE1-NLRP3信号通路和PERK-LCN2信号通路对吗啡镇痛耐受及吗啡诱导的痛敏的影响。方法:(1)不同组别大鼠分别鞘内注射吗啡、吗啡+4-PBA和吗啡+TUDCA,每天两次,连续七天,通过甩尾实验观察内质网应激抑制剂对吗啡镇痛和耐受的影响,采用Von Frey纤维丝测定机械痛阈值。通过Western Blot检测吗啡是否诱导内质网应激,NLRP3炎性小体的激活和LCN2蛋白的表达。通过免疫荧光检测吗啡耐受大鼠脊髓背角中未折叠蛋白的堆积。(2)体外吗啡处理星形胶质细胞系C6,通过Western Blot检测内质网应激相关蛋白的表达情况,以及NLRP3炎性小体和LCN2的表达情况。(3)大鼠鞘内分别注射IRE1内切酶抑制剂STF-083010和炎性小体抑制剂β-羟丁酸(β-HB),通过甩尾观察对吗啡镇痛和耐受的影响,采用Von Frey纤维丝测定机械痛阈值。通过Western Blot检测NLRP3炎性小体的激活情况。(4)大鼠鞘内分别注射PERK抑制剂GSK2656157和LCN2干扰RNA,通过甩尾观察对吗啡镇痛和耐受的影响,采用Von Frey纤维丝测定机械痛阈值。通过Western Blot检测LCN2蛋白的表达情况。(5)建立糖尿病大鼠模型,鞘内分别注射吗啡、吗啡+4-PBA和吗啡+TUDCA,通过福尔马林疼痛实验检测内质网应激抑制剂对糖尿病痛敏的影响。(6)建立SNI大鼠模型,鞘内分别注射吗啡、吗啡+4-PBA和吗啡+TUDCA,通过Von Frey纤维丝测定机械痛阈值。结果:(1)鞘内给药内质网应激抑制剂4-PBA和TUDCA可以增强吗啡的镇痛,缓解吗啡耐受和痛敏。在吗啡量效曲线实验中,4-PBA和TUDCA可以阻止吗啡耐受曲线右移。在吗啡耐受后给予4-PBA和TUDCA可以反转吗啡耐受的现象。(2)免疫荧光结果显示吗啡耐受大鼠脊髓中出现未折叠蛋白反应,Western Blot结果显示吗啡耐受大鼠脊髓内质网应激相关蛋白表达增加。(3)吗啡耐受大鼠脊髓Western Blot结果显示NLRP3炎性小体激活,LCN2蛋白表达增加,分别给予IRE1内切酶抑制剂STF-083010和炎性小体抑制剂β-羟丁酸(β-HB),PERK抑制剂GSK2656157和LCN2干扰RNA均可以缓解吗啡耐受和痛敏。(4)内质网应激抑制剂4-PBA和TUDCA可以缓解糖尿病大鼠的福尔马林诱导的疼痛。(5)内质网应激抑制剂4-PBA和TUDCA可以缓解SNI大鼠模型的痛敏现象。结论:内质网应激的IRE1-NLRP3炎性小体信号通路和PERK-LCN2信号通路参与吗啡耐受的形成和发展。