论文部分内容阅读
前言热休克蛋白（HSPs）是生物体在应急条件下产生的一组蛋白,又称为应急蛋白（stress protain）,广泛存在于原核真核生物中,高度保守。目前可分为HSP90、HSP70、HSP60及小HSP60四个家族。HSP70在正常细胞中广泛存在,多存在于细胞内,正常细胞中水平较低,应激状态下显著增高。但研究发现在许多肿瘤细胞中HSP70过表达。HSP70在正常细胞表面不表达,被认为是肿瘤细胞表面的特异性结构。研究发现引起肿瘤免疫应答的成分是HSP70,而肿瘤细胞的HSP70序列与正常组织细胞的HSP70序列几乎完全相同,进一步研究发现肿瘤免疫应答的关键是HSP70结合的小肽。由此认为来源于肿瘤细胞HSP70的肿瘤肽,具有肿瘤免疫作用。锂盐在临床上主要用于治疗精神方面疾病,也可升高外周血中肿瘤坏死因子（TNF）的水平,使细胞对TNF介导的凋亡和坏死敏感。锂盐有相对宽泛的安全范围,常可以在未显示其毒性的情况下上调TNF水平。安全、通常不致出现副反应是其特点。HSP70在肿瘤细胞中高表达,是肿瘤细胞进行增殖和生存所必需,且可通过抑制其表达诱发肿瘤细胞凋亡而抑制肿瘤的增殖。HSP70与人单核细胞表面结合,能刺激单核细胞产生TNF-a等细胞因子,也可诱导体内的T细胞高表达TNF-a等细胞因子,达到抑制肿瘤细胞生长及杀伤肿瘤细胞的目的。锂盐可以升高TNF-α等细胞因子的水平,并能直接影响c-fos等原癌基因的表达;而Hcal细胞的HSP70携有肿瘤肽能激发机体的抗肿瘤免疫,同时也可升高IL-2、TNF-α等细胞因子的水平,达到抑制肿瘤生长的目的。本试验对纯系615小鼠的Hcaf肿瘤细胞,通过超声粉碎、层析,梯度洗脱、纯化、鉴定,获得肿瘤来源的HSP70;并研究不同剂量LiCl对体外培养的Hcal细胞的作用及对Hcal细胞的HSP70表达的影响;还通过应用LiCl、Hcaf细胞的HSP70和健康小鼠组织的HSP70作用于由Hcaf细胞建立起来的615小鼠肿瘤模型,观察小鼠外周血中细胞因子TNF-α的变化及抗肿瘤效果。材料与方法第一部分实验经过对Hcaf细胞超声粉碎,20000r/min,高速冷冻离心1小时,经ConA-sepharose柱层析,收集未结合部分透析,经DEAE柱层析,用FPLC-system梯度洗脱结合在DEAE柱上的部分,收集各个峰值的蛋白样品,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）证明C峰的样品为分子量70KD的蛋白。经过蛋白免疫印迹（Western-blotting）验证,此样品为HSP70。经过纯化、冷冻抽干、过滤除菌,-70℃保存。以备进行HSP70的抗肿瘤实验。第二部分实验应用LiCl、HcaF细胞的HSP70和健康小鼠组织的HSP70作用于由HcaF细胞建立起来的615小鼠肿瘤模型,观察小鼠外周血中细胞因子TNF-α水平的变化及抗肿瘤效果。第三部分实验通过不同剂量的LiCl,作用于用RPMI-1640培养液体外培养的Hcaf细胞的作用,在不同时间点取样,分别用碘化丙锭（PI）、兔抗小鼠HSP70抗体和FITC标记的羊抗兔IgG抗体染色,观察Hcaf细胞周期变化及对Hcaf细胞HSP70表达的影响,并通过扫描电镜观察Hcaf细胞的超微结构。结果第一部分实验经对HcaF细胞超声粉碎、离心、层析,用FPLC-system梯度洗脱,收集各个峰值样品,C峰的样品经SDS-PAGE证明为70KD蛋白,经Western-blotting验证为HSP70:第二部分给予健康的615小鼠组织的HSP70对肿瘤组织的抑制作用与对照组相比差别不显著;与对照组比较,LiCl组和Hcaf细胞HSP70组的抑瘤作用差别显著,但两组之间抑瘤作用差别无统计学意义;合用LiCl和Hcaf细胞HSP70组,抑瘤作用最显著。正常组织的HSP70注射后TNF-a略升高,但与对照组相比无统计学意义。LiCl组,Hcaf细胞HSP70组的TNF-a升高,P＜0.05有统计学意义;LiCl与Hcaf细胞HSP70合用组TNF-a升高与单用LiCl,Hcaf细胞HSP70组比较,无显著差别。第三部分实验组细胞8小时,24小时,48小时“亚二倍体峰”逐渐增大,G0/1期DNA含量逐渐减少,二倍体峰缩小;G2M期DNA含量升高,四倍体增加;S期的DNA含量也增加,而对照组细胞生长良好,细胞周期未见“亚二倍体峰”,结果显示经氯化锂处理后,Hcaf细胞发生周期阻滞;第三部分实验组的Hcaf细胞经LiCl处理8小时后,FITC标记的HSP70平均荧光强度增高,显示实验组同对照组比较HSP70表达增强。对照组的荧光强度与单用二抗比较无明显升高。氯化锂（60ug/ml）组作用8小时,收集的Hcaf细胞经透射电镜观察的结果:显示Hcaf细胞体积变大,边缘可见vi;胞质变化不明显,核大,可见核仁,异染色质积聚成团块状,分布在核仁内侧;细胞边缘膨出,起泡,Vi;细胞出现凋亡小体,细胞发生凋亡。结论1.Hcaf细胞经超声波粉碎,ConA-sepharose柱和DEAE柱层析,洗脱,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、Western-blotting鉴定:FPLC-system洗脱收集得到的C峰蛋白为热休克蛋白70。2.LiCl,Hcaf细胞来源的HSP70可以升高615小鼠外周血中的TNF-a水平,有抑制肿瘤生长的作用。3.LiCl和Hcaf细胞来源的HSP70合用可以升高615小鼠外周血中的TNF-a水平,抑瘤作用显著;健康615小鼠组织来源的HSP70与对照组比较抑瘤作用不明显4.LiCl对体外培养的Hcaf肿瘤细胞的生长有抑制作用;能增强体外培养的Hcaf细胞HSP70的表达。