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目前,抗CD3单克隆抗体已广泛应用于临床治疗器官移植后排斥反应,疗效显著,但机体易产生特异性免疫反应,导致鼠源性抗CD3单克隆抗体被快速清除,半衰期明显缩短,从而限制了其治疗作用。PEG修饰蛋白是蛋白类药物二次开发中的一项热点技术,PEG与药物相连,能有效延长药物的半衰期,降低药物的免疫原性。本文利用PEG修饰鼠源性抗CD3单克隆抗体,拟有效改善其生物学活性,提高临床应用效果。本实验首先以胃蛋白酶酶解鼠抗人CD3单克隆抗体,然后通过凝胶层析分离及超滤纯化得到抗体Fab′,并利用SDS-PAGE检测纯度。通过单因素试验确定胃蛋白酶与抗体的物质量之比为2:100,消化24h,反应体系pH值为3.0及温度为37℃的酶解条件,以及巯基乙醇摩尔浓度为0.1mol/L,消化30min的F(ab′)2制备Fab′抗体反应条件。结果得到纯度较高的抗体Fab′,并利用薄层扫描纯度均达到95%以上。接着利用PEG—SPA修饰抗体和抗体片段Fab′,并对鼠抗人抗CD3单克隆抗体和抗体片段的PEG化反应条件进行了优化。通过正交确定了较佳的修饰工艺条件。结果表明,在pH9.0硼酸缓冲液,反应温度25℃,抗体浓度0.2mg/ml,抗体和PEG摩尔比为1:20,反应3小时,所得到的修饰效果最好。其次通过PEG化抗体IgG和抗体片段Fab′的体内以及体外T细胞增殖实验,考察了修饰后的抗体和抗体片段的免疫活性,实验结果显示:修饰后抗CD3单抗全抗,对T淋巴细胞增殖抑制活性下降了32.28%,抗体Fab′下降了7.96%,PEG化Fab′下降了19.92%,其对T细胞抑制率有所下降,但细胞毒性增强不明显。最后利用ELISA法测血液中修饰后的抗体和抗体片段的半衰期。结果显示:mPEG修饰后抗体和抗体片段血药浓度降低明显减缓,修饰后抗CD3抗体半衰期从2.658347h延长到8.722217h,延长了3.28倍。而修饰后抗体Fab′片段半衰期从2.209713h延长到4.1723h,延长了1.895倍。由此我们可发现,利用低分子量的PEG修饰抗体,降低抗体本身的免疫原性,延长其半衰期这一方法,具有较好的可行性,且可极大的提高单克隆抗体尤其是非人源性抗体在临床上的应用。