背景动脉粥样硬化性肾病(atherosclerotic renal disease,ARD)是指因动脉粥样硬化引起肾动脉狭窄和血流量减少,而导致的肾脏损伤,是引起终末期肾脏病(end stage renal disease,ESRD)的主要原因。随着肾灌注的不断减少,肾小管周围微血管内皮逐渐受损,呈现稀疏化,“微血管荒废—小管间质纤维化”的病理链逐渐形成,这是ARD进展的关键病理环节。目前针对ARD的治疗,主要包括药物治疗与血管重建术,以控制血压、血脂、减少心血管事件发生概率和保护肾功能,但是治疗的效果并不理想,疾病的肾脏终点并未得到改善。这也提示临床工作者在ARD的治疗过程中,应积极寻找新的干预措施和治疗靶点,如选择决定ARD患者肾脏预后的小管间质纤维化作为切入点。研究发现,当小管间质微血管受到损伤时,小管间质纤维化的速度可以明显加快,因此从保护小管间质微血管内皮的角度,探寻延缓ARD小管间质纤维化的措施具有重要意义。硫酸吲哚酚(indoxyl sulfate,IS)作为一种肠源性尿毒症毒素,由肠道微生物分解色氨酸并经肝脏转化而成,主要通过肾脏清除。当肾功能下降时,IS在体内明显蓄积,因为其易与蛋白质结合,而不易被透析清除。IS可通过活化芳香烃受体(Aryl hydrocarbon receptor,AhR),并进一步激活烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸酶氧化剂-4(Nicotinamide adenine dinucleotide phosphatase oxidase 4,NOX4),诱导氧化应激和炎症反应,导致内皮功能障碍,引起微血管荒废,加速小管间质纤维化。因此,在IS刺激条件下,AhR/NOX4通路激活并介导的的氧化应激和炎症反应,可能是ARD进展中小管间质微血管损伤的主要机制,从而加重了小管间质纤维化。本课题组基于既往的证候学研究和临床经验,考虑ARD的基本病机以脾肾气虚为本,湿、浊、瘀、毒夹杂为标。知名肾病专家戴希文教授结合多年治疗慢性肾脏病的临床经验,提出了益气活血、利湿降浊解毒的益肾缓衰方,与ARD的基本病机相吻合,在延缓ARD肾功能进展方面具有一定的临床疗效。益肾缓衰方相关的基础研究提示,该方在保护血管内皮和改善小管间质纤维化方面具有重要作用。鉴于IS与中医“浊毒”致病特点类似,且IS可通过活化AhR,激活NOX4,进而损伤血管内皮,因此可以考虑益肾缓衰方对小管间质微血管的保护作用可能与该方抑制IS的毒性作用有关,并提出“益肾缓衰方可能通过调控IS介导下的AhR/NOX4通路,改善微血管荒废,减轻小管间质纤维化,从而延缓ARD进展”的假说。围绕此假说,本研究首先对ApoE基因敲除小鼠使用高脂饮食喂养联合5/6肾切除构建ARD模型,观察益肾缓衰方对ARD小鼠血清IS水平、小管间质微血管损伤、小管间质纤维化以及AhR/NOX4通路相关分子表达水平和下游氧化应激、炎症分子变化的影响。其次,采用IS刺激人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)构建毒素损伤细胞模型,观察益肾缓衰方含药血清对IS诱导下HUVECs活力、衰老和氧化应激以及AhR/NOX4通路的的影响,旨在从IS角度出发,阐述益肾缓衰方对ARD间质微血管的保护作用和机制,为该方延缓ARD小管间质纤维化提供一定的理论依据。目的1.观察益肾缓衰方对ARD小鼠血清IS水平的变化、小管间质纤维化以及小管周围微血管内皮损伤的影响,以及该方对IS诱导下血管内皮细胞损伤的保护作用。2.从IS激活AhR/NOX4通路,并诱导氧化应激和炎症反应角度,揭示益肾缓衰方对ARD小管间质微血管的保护作用和机制,为该方延缓ARD小管间质纤维化提供一定的理论依据。方法1.体内实验:通过对ApoE基因敲除(ApoE-/-)小鼠使用高脂饮食喂养联合5/6肾切除构建ARD模型。实验分为:对照组、假手术组、模型组、益肾缓衰方低剂量组(16.76g/kg.d)、益肾缓衰方中剂量组(33.52g/kg.d)、益肾缓衰方高剂量组(67.04g/kg.d)、爱西特组(0.4g/kg.d),干预20周。观察小鼠一般情况,并利用自动生化仪检测小鼠肾功能(Scr、BUN)和血脂水平变化(TC、TG、LDL-c),高效液相色谱-荧光法测血清IS水平、Elisa法测氧化应激指标(SOD、MDA)及小鼠血清内皮功能障碍指标(ADMA)水平、HE染色和VG染色判断肾动脉的动脉粥样硬化程度,HE染色、PAS染色、Masson染色判断肾组织的组织形态学变化及间质胶原沉积,电镜观察肾脏的超微结构,免疫组化检测小鼠间质纤维化相关指标(Collagen Ⅳ、α-SMA、TGF-β1)、AhR蛋白及肾间质内微血管内皮保护指标(vWF)表达水平,real time PCR检测小鼠肾组织内AhR/NOX4通路相关分子(AhR、NOX4、MCP-1)以及间质纤维化相关指标(TGF-β1)的mRNA表达水平。2.体外实验:采用500μmol/LIS刺激HUVECs 24h建立内皮损伤的毒素模型。首先,通过 CCK-8 法检测不同浓度 IS(0μmol/L、250μmol/L、500μmol/L、1000μmol/L)刺激后HUVECs活力变化及不同浓度益肾缓衰方含药血清(5%、10%、20%)对IS刺激下HUVECs活力的影响,同时确定IS的造模浓度和含药血清的干预浓度。其次,将实验分为:空白对照组、含药血清对照组、毒素模型组和含药血清实验组,并通过SA-β半乳糖苷酶法检测各组细胞衰老程度、化学荧光微孔板法检测各组细胞ROS生成量。最后,增加AhR抑制剂组(CH223191)及AhR抑制剂+含药血清组,并进一步检测各组细胞的细胞活力、细胞衰老情况、ROS生成量,并通过Western blot检测AhR与NOX4的蛋白表达,real time PCR法检测AhR、NOX4及炎症因子MCP-1的mRNA表达。结果1.体内实验:(1)与对照组比,假手术组小鼠体重虽增加,但无统计学意义(P>0.05);血清TC、TG、LDL-c水平明显升高(P<0.05),血清SOD活性明显下降(P<0.05),但血清Scr、BUN、IS水平、MDA及ADMA含量升高均不明显(P>0.05);肾动脉内膜增厚、管腔狭窄,肾小管扩张,肾小管超微结构未见明显异常,肾间质胶原纤维沉积不明显(P>0.05);肾间质内TGF-β1、Collagen Ⅳ、α-SMA、AhR蛋白表达水平未见明显增加(P>0.05),肾间质内vWF蛋白表达水平下降(P<0.05);肾组织内AhR、TGF-β1及NOX4 mRNA表达水平的变化无统计学差异(P>0.05),但MCP-1 mRNA表达水平增加,有统计学意义(P<0.05)。(2)与对照组比,模型组小鼠体重无明显差异(P>0.05);Scr、TC、TG、LDL-c和血清IS水平显著升高(P<0.05);血清SOD活性下降而MDA、ADMA含量增加(P<0.05);肾动脉内膜增厚、管腔狭窄,肾小球硬化,肾小管空泡样变性、腔内微绒毛稀疏和缺失,且小管间质纤维化明显;肾间质胶原纤维沉积明显增加(P<0.05);肾间质vWF蛋白表达水平下调而CollagenⅣ、α-SMA、TGF-β1及AhR蛋白表达水平增加(P<0.05);肾组织内AhR、NOX4、TGF-β1及MCP-1 mRNA表达水平增加(P<0.05)。(3)与假手术组比,模型组小鼠体重平均水平较假手术组低,但仅在饮食干预8周时显示有统计学差异(P<0.05);血清Scr、IS、MDA及ADMA水平更高(P<0.05),而血脂水平及SOD活性无明显差异(P>0.05);肾动脉内膜增厚及管腔狭窄程度更加明显,肾小球硬化更加明显,腔内微绒毛稀疏和缺失,肾间质胶原纤维沉积更加明显(P<0.05);肾间质 Collagen Ⅳ、α-SMA、TGF-β1、AhR及 vWF 蛋白表达水平明显增加(P<0.05);肾组织内TGF-β1、AhR、NOX4及MCP-1 mRNA表达水平增加更加明显(P<0.05)。(4)与模型组比较,益肾缓衰方低剂量、中剂量组,对小鼠体重影响不明显(P>0.05),高剂量组和爱西特组在干预20周时,体重明显低于模型组(P<0.05);益肾缓衰方低、中、高剂量组及爱西特组均可显著降低小鼠血清Scr和血清IS水平(P<0.05),但对BUN及血脂水平的改变均不明显(P>0.05);益肾缓衰方低剂量组可明显增加小鼠血清SOD活性、降低小鼠血清MDA和ADMA含量(P<0.05),中剂量和高剂量组可明显降低小鼠血清MDA(P<0.05),爱西特组可明显增加小鼠血清SOD活性并降低小鼠血清MDA含量(P<0.05);益肾缓衰方低、中、高剂量组均可在一定程度改善肾动脉内膜增厚情况、肾小管空泡样变性以及肾小管的超微结构,但仅低剂量组可明显减轻肾间质胶原纤维沉积(P<0.05);益肾缓衰方低剂量组和中剂量组均可明显减少肾间质Collagen Ⅳ、α-SMA、AhR蛋白表达,并增加肾间质vWF蛋白的表达(P<0.05);益肾缓衰方低剂量组和中剂量组均可明显减少肾组织AhR、NOX4、MCP-1 mRNA的表达水平(P<0.05),且益肾缓衰方低剂量组对于减少肾组织内TGF-β1蛋白和mRNA的表达量,均具有统计学差异(P<0.05)。益肾缓衰方高剂量组和爱西特组对肾组织Collagen Ⅳ、α-SMA、TGF-β1、AhR和vWF的蛋白表达及TGF-β1、AhR、NOX4及MCP-1的mRNA表达无统计学差异(P>0.05)。2.体外实验:(1)与 0μmol/LIS 组比,500μmol/LIS 组与 1000μmol/LIS 组在干预24h、48h、72h后,均可以显著降低HUVECs活力(P<0.05),250μmol/L IS组在干预48h时可显著降低HUVECs活力(P<0.05),但1000μmol/LIS干预后细胞数目呈下降趋势。(2)与同等浓度的正常大鼠血清组比,在IS刺激条件下,10%和20%的含药血清可显著增加细胞活力(P<0.05);在无IS刺激条件下,5%和10%含药血清组对细胞活力无明显影响(P>0.05),20%的含药血清可显著增加细胞活力(P<0.05)。(3)与空白对照组比较,含药血清对照组对细胞活力、细胞衰老、ROS生成及AhR和NOX4的蛋白和mRNA表达均无显著影响(P>0.05)。(4)与空白对照组比,毒素模型组的细胞活力下降、衰老细胞染色率增加及ROS相对生成量增加(P<0.05),细胞核内AhR蛋白及NOX4蛋白表达增加,AhR、NOX4及MCP-1的mRNA表达增加(P<0.05)。(5)与毒素模型组比较,含药血清实验组、AhR抑制剂组、AhR抑制剂+含药血清组均可明显增加细胞活力、降低衰老细胞染色率及ROS相对生成量(P<0.05),下调AhR蛋白及NOX4蛋白表达水平,下调AhR、NOX4及MCP-1的mRNA表达水平(P<0.05)。(6)与AhR抑制组比,AhR抑制剂+含药血清组在增加细胞活力、降低衰老细胞染色率及ROS相对生成量,以及下调AhR蛋白及NOX4蛋白表达水平和AhR、NOX4及MCP-1的mRNA表达水平方面效果更加显著(P<0.05)。结论1.益肾缓衰方可改善ARD小鼠肾功能以及肾动脉和肾组织的病理形态学损伤,减轻小鼠肾间质纤维化,从而延缓ARD进展。2.益肾缓衰方可通过降低ARD小鼠血清IS水平并改善ARD模型小鼠体内IS对血管内皮的损伤,改善小管间质微血管荒废,进而减轻小管间质纤维化。3.益肾缓衰方能够改善ARD小鼠小管间质微血管荒废和IS诱导的人脐静脉内皮细胞的损伤,机制可能与该方抑制IS诱导下AhR/NOX4通路的激活,进而改善下游的氧化应激和炎症反应有一定的关系。