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脂肪酶(lipase,EC3.1.1.3,triacylglycerolacylhydrolase,甘油三酰酯水解酶)是一类能催化长链脂肪酸甘油酯水解为长链脂肪酸和甘油的酶类。广泛存在于动物、植物和微生物中,微生物脂肪酶因其资源丰富、种类多、稳定性好、容易批量生产、生产周期短、生产成本低等优点而被广泛地应用于食品加工、精细化工、油脂化学、手性化合物拆分、生物柴油合成、高分子材料制备等诸多工业领域。鉴于脂肪酶重要的工业应用价值、巨大的需求潜力以及当前制备的高成本,寻找高产脂肪酶菌株仍然是所有研究开发工作的基础。本研究从云南丫沙底温泉池底泥中采样分离1株具有产脂肪酶能力的菌株HS-BTL2,其脂肪酶活力为3.87U/mL。对脂肪酶菌株HS-BTL2进行形态学观察、生理生化鉴定并结合16S rDNA分子鉴定,表明HS-BTL2为嗜热芽孢杆菌(Bacillus thermophilus)。分别提取脂肪酶菌株HS-BTL2和本实验室原来筛选并保存的产脂肪酶菌株(铜绿假单胞菌Pseudomonas.sp)HS-L6的基因组DNA,对两株产脂肪酶菌基因组DNA进行扫描测序。测得HS-BTL2基因组4041705bp,预测基因5881个;HS-L6基因组4496304bp,预测基因4976个。对基因组进行GO功能分析,发现具有注释信息的基因数为2078个和3821个。对两株菌扫描基因组进行脂肪酶相关基因簇进行分析,其中HS-BTL2与脂肪降解相关的是一个包含编码41个开放阅读框的基因簇;HS-L6与脂肪降解相关的是一个包含19个开放阅读框的基因簇。同时对两株菌有关脂肪酶的代谢通路进行了初步分析。脂肪酶进行规模化生产的重要前提是构建高效的基因工程菌。毕赤酵母(Pichiapastoris)表达系统因其具有外源蛋白表达量高、生长快、营养要求低、适于高密度发酵等优点而广泛应用于生产。由于毕赤酵母和嗜热芽孢杆菌在密码子使用频率上的巨大差异,使其原有密码子在毕赤酵母中整体表达频率较低。本研究对嗜热脂肪酶基因btl的密码子进行了优化设计:选择酵母偏爱的密码子、基因能量较高而mRNA二级结构的稳定性较低、去除富含AT的区域。利用DNAworks在线软件设计引物人工合成优化了的HS-btlm基因,构建了重组表达质粒pPICZαA-HS-btlm,并在毕赤酵母GS115中实现了分泌表达。重组工程菌在最佳的诱导条件下诱导96h,重组脂肪酶HS-BTLm活力达到64.97U/mL。在毕赤酵母表达系统中,基因的拷贝数是重组蛋白生产表达的一个限制因素。在大多数情况下,基因表达盒拷贝数的增加可以显著提高重组蛋白的表达水平。本文通过体外分别构建含2、4拷贝目的基因的重组酵母表达盒,实现了重组蛋白在毕赤酵母中的高效表达,其蛋白表达水平分别增加了 2.6(174.93 U/mL)和3.2倍(210.83 U/mL)。通过荧光定量PCR研究了不同目的基因拷贝数和目的基因mRNA水平的关系,初步推断目的基因拷贝数和目的蛋白在毕赤酵母中分泌表达之间的关系,并分析了不能完全成线性比例的原因。纯化后的重组脂肪酶HS-BTLm进行了功能鉴定。结果表明其最佳反应pH为8.0;在50℃时稳定性最强;有机溶剂TritonX-100、Tween-80和Ca2+、Mg2+、Mn2+等金属离子可以促进重组酶HS-BTLm的活力;有机溶剂Tween-20、SDS、胆盐、甲醇、丙胺、丙酮和Cu2+、Zn2+金属离子以及PMSF、EDTA金属螯合剂均抑制重组脂肪酶的活性。克隆了铜绿假单胞菌株HS-L6的脂肪酶基因HS-lip6,并在大肠杆菌中成功表达。运用生物信息学方法,从NCBI数据库中查到铜绿假单胞菌脂肪酶基因的同源基因TE3285。根据该基因序列,设计引物扩增得到铜绿假单胞菌脂肪酶全长基因HS-lip6,该基因片段长2008bp(其中编码序列1959 bp,重复序列49bp),编码652个氨基酸。将该基因与TE3285序列进行同源比对,结果有15个碱基发生突变,编码氨基酸序列有10处不同。构建了重组表达质粒pET-HHS-lip6,并实现了HS-lip6的异源表达。在37℃条件下,重组蛋白LIP6主要以包涵体形式存在。降低诱导表达温度,分别在28℃和18℃下对重组菌株进行诱导表达,超声破碎后SDS-PAGE分析发现,脂肪酶在大肠杆菌中表达成功。检测脂肪酶活力为15.65U/mL。为了进一步提高脂肪酶的活性,分别从脂肪酶菌株HS-L6中克隆了脂肪酶基因lipA以及脂肪酶折叠蛋白基因lipB。构建了重组表达质粒pET-lipA及pET-lipB,其中脂肪酶折叠蛋白LIPB在大肠杆菌中实现了分泌表达;脂肪酶LIPA则以包涵体的形式存在,通过8M的尿素处理重组脂肪酶LIPA使之复性。同时构建了脂肪酶LIPA和脂肪酶折叠蛋白LIPB的真核表达质粒pPICZαA-lipA及pPICZαA-lipB,并在毕赤酵母中实现了分泌表达。对脂肪酶LIPA和脂肪酶折叠蛋白LIPB进行体外折叠复性,并研究了体外折叠复性过程中的影响因素。结果显示脂肪酶折叠蛋白LIPB促进脂肪酶LIPA的最佳浓度为0.005 mg/mL。