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一、研究背景在骨折愈合过程中,成骨细胞是骨修复和骨重建最为重要的细胞之一,主要依赖于微环境中连绵不绝的营养供应及促生存信号才能维持其正常的生理功能;当骨组织发生病变或者损伤导致营养因子供应受到限制时,成骨细胞将会发生超出正常生理状态的凋亡率,由此对骨的重塑造成了严重的影响。研究发现神经系统可以调节骨组织的各项生理功能,降钙素基因相关肽(CGRP)作为广泛分布于神经系统中的神经递质,对骨形成和骨吸收起着重要的作用。本课题组在前期研究中已经证实CGRP在颌骨骨折的愈合过程中起着重要的促进作用。成骨细胞表面存在CGRP受体,CGRP通过结合受体发挥对成骨细胞活性的直接调节作用,CGRP对成骨细胞的作用分子机制已有大量研究。近期研究证明CGRP能够通过抑制成骨细胞的凋亡进而抑制骨的丢失,对成骨细胞具有潜在的保护作用,但具体机制尚不完全清楚。自噬(autophagy)是一种细胞应对不利环境的一种自我保护机制,是将受损或异常的细胞器和蛋白质通过双层膜结构转运发至溶酶体降解循环再利用的过程。凋亡(apoptosis)是细胞受基因控制的一种主动的有序的死亡方式。骨折愈合过程中同时伴随着凋亡与自噬的发生,两者如何互相作用共同促进骨折愈合的具体机制尚不清楚。本实验旨在验证CGRP对饥饿条件下成骨细胞抗凋亡作用,发现其对饥饿条件下成骨细胞自噬活性的影响作用,再对两者相互的关系进行了初步的探索。首次从自噬入手,试图进一步揭示CGRP对成骨细胞发挥保护作用的机制。二、研究方法成骨细胞于血清饥饿条件(α-MEM培养基、0%FBS、100U/ml青-链霉素)下培养12h、24h后通过流式细胞术和Western blotting分别检测其凋亡率和自噬相关蛋白LC3的表达。自噬抑制剂3-MA预处理成骨细胞细胞1h后血清饥饿培养24h,采用流式细胞术检测细胞凋亡。在血清饥饿条件下加入不同浓度的CGRP培养24h,采用Western blotting检测LC3蛋白和P62蛋白,筛选出对自噬优势作用浓度;通过加入CGRP后不同时间段采用Western blotting检测LC3蛋白,筛选出CGRP作用于饥饿条件下成骨细胞自噬作用的优势作用时间段。CGRP作用于血清饥饿条件下培养成骨细胞24h,采用流式细胞术检测细胞凋亡,并采用共聚焦激光显微镜观察MDC染色细胞自噬体和LC3免疫荧光染色。在血清饥饿条件下使用自噬抑制剂抑制3-MA预处理细胞后加入CGRP培养24h,采用流式细胞术检测细胞凋亡。三、研究结果1.血清饥饿会诱导成骨细胞凋亡率升高,通过Western blot检测显示血清饥饿会诱导成骨细胞LC3Ⅱ/Ⅰ比值升高。2.自噬抑制剂3-MA预处理可以增加血清饥饿条件下成骨细胞凋亡率。3.CGRP可以抑制血清饥饿诱导成骨细胞的凋亡。CGRP作用于血清饥饿条件下成骨细胞24h,随着加入CGRP浓度的逐渐升高,LC3Ⅱ/Ⅰ比值差异逐渐上升,P62表达逐渐下降,在CGRP浓度为10-8mol/L是差异较为明显。CGRP作用于血清饥饿条件下成骨细胞不同时间段,在24h时LC3Ⅱ/Ⅰ比值差异最为明显。CGRP诱导血清饥饿条件下成骨细胞自噬体形成及LC3蛋白表达。4.自噬抑制剂3-MA预处理后可以增加血清饥饿条件下成骨细胞的凋亡率,CGRP则能部分逆转自噬抑制剂3-MA预处理后所致的血清饥饿条件下成骨细胞的凋亡。四、结论1.本研究验证血清饥饿会诱导成骨细胞凋亡及自噬活性的升高,抑制血清饥饿条件下成骨细胞的自噬活性会诱导凋亡率的升高。2.本研究证实CGRP抑制血清饥饿诱导成骨细胞的凋亡的同时诱导血清饥饿条件下成骨细胞自噬活性增强。本研究证实CGRP能部分逆转自噬抑制所致的血清饥饿条件下成骨细胞的凋亡,可能通过诱导成骨细胞自噬活性。