研究背景:帕金森病（Parkinson’s disease,PD）是一种中老年常见的神经系统退行性变性疾病,据统计65岁以上人群的罹患率达1-2%。其临床上表现以震颤、强直、运动迟缓和姿势步态异常为主要特征;其病理学特征表现为中脑黑质致密部（substantia nigra pars compacta,SNc）多巴胺（dopamine,DA）能神经元选择性、进行性丧失和残存DA能神经元内Lewy小体（主要成分为alpha-synuclein）的形成。尽管如此,其具体发病机制仍不太清楚。目前关于PD的治疗,不管是药物治疗还是手术治疗（定向核团毁损和深部脑刺激）,仅仅针对症状,而达不到根治,这主要与它进行性神经变性的病理特征有关。因为随着病理程度的进一步恶化,使得暂时被药物或手术所控制的症状再度出现,形成“新的PD症状”。由此可见,从源头上干预这种进行性神经变性,从PD发病机制的“根”开始“斩草”,成为治愈PD的焦点。神经营养因子因其对神经发生、生存、生长、分化及迁移等具有调节作用,成为神经元生长、存活和功能维护所必需的蛋白质分子。近年来多项研究表明,保守型多巴胺能神经元营养因子（conserved dopamine neurotrophic factor,CDNF）CDNF不仅能显著改善6-OHDA诱导的PD模型大鼠行为,还能对其中脑黑质致密部的DA能神经元变性具有显著的保护和逆转复苏作用。然而,6-OHDA（6-hydrox-ydopamine）诱导的PD模型是通过氧化应激产生细胞毒性导致DA能神经元变性来实现的,而目前帕金森病的发病机制认为蛋白质降解系统受损导致细胞清除异常蛋白的能力减弱甚至丧失,由此引起的蛋白水解应激是PD发病机制中的共同通路。泛素-蛋白酶体作为细胞内的蛋白降解途径,在细胞内异常蓄积蛋白的降解过程中扮演重要角色,通过及时有效降解细胞内异常蓄积发挥神经保护作用。因此,本研究目的首先在于明确CDNF对蛋白酶体抑制诱导的PD模型是否具有神经保护和逆转作用,在此基础上进一步探索其对蛋白酶体表达水平、水解酶活性的调控作用。以此来论证这种“CDNF—蛋白酶体—保护和逆转DA能神经元”新型神经保护机制的设想,阐明蛋白酶体系统功能活性在“CDNF保护和逆转DA能神经元变性机制”中的作用,为CDNF对DA能神经元变性保护和逆转作用机制的研究开辟新靶点。方法:研究一、CDNF对蛋白酶体抑制诱导DA能神经元变性的作用首先,构建CDNF基因重组杆状病毒表达载体Bacmid-CDNF,稳定转染Sf9昆虫细胞,采取Bac-to-Bac蛋白表达系统,按照分子克隆方法完成CDNF蛋白的大量表达、鉴定和纯化,以备后续实验所用。选取PC12细胞株作为诱导PD细胞模型细胞株。将实验设计为五组分别是:实验组（Lactacystin/MG132）、CDNF+Lactacystin 组、CDNF+MG132 组、Lactacystin+CDNF 组和 MG132+CDNF组。先将PC12细胞种植在96孔板上（细胞密度达到2×105/ml）孵育24h。为了探讨索CDNF对PC12细胞株的神经保护作用,在细胞进行Lactacystin/MG132诱导前施加200nM的CDNF作用6h,然后再分别加入12.5μM Lactacystin或5μM MG132诱导24h。为了探讨CDNF对PC12细胞的神经逆转作用,先分别对其加入12.5μM Lactacystin或5μM MG132进行诱导24h,然后再分别加入相同剂量（200nM）CDNF进行共孵育24h。最后通过MTT法检测PC12细胞活性、TH免疫荧光检测细胞形态以及免疫荧光技术检测alpha-synuclein蛋白的表达量。研究二、CDNF对蛋白酶体表达以及水解酶活性的调控作用首先,构建CDNF基因重组杆状病毒表达载体Bacmid-CDNF,稳定转染Sf9昆虫细胞,采取Bac-to-Bac蛋白表达系统,按照分子克隆方法完成CDNF蛋白的大量表达、鉴定和纯化,以备后续实验所用。选取PC12细胞株作为诱导PD细胞模型细胞株。将实验设计为五组分别是:实验组（Lactacystin/MG132）、CDNF+Lactacystin 组、CDNF+MG132 组、Lactacystin+CDNF 组和 MG132+CDNF组。先将PC12细胞种植在96孔板上（细胞密度达到2×105/ml）孵育24h。为了探讨CDNF对蛋白酶体的保护作用,在细胞进行Lactacystin/MG132诱导前施加200nM 的 CDNF 作用 6h,然后再分别加入 12.5μM Lactacystin 或 5μM MG132诱导24h。为了探讨CDNF对蛋白酶体的逆转作用,先分别对其加入12.5μM Lactacystin或5μM MG132进行诱导24h,然后再分别加入相同剂量（200nM）CDNF进行共孵育24h。最后通过ELISA法检测26s蛋白酶体的表达以及谷氨酰肽水解酶、糜蛋白酶和胰蛋白酶的含量。统计学分析CDNF对Lactacystin/MG132诱导前后的蛋白酶体和三种水解酶的表达情况,以及Lactacystin与MG132两种蛋白酶体抑制剂之间对蛋白酶体和三种水解酶作用的差异。结果:研究一、CDNF对蛋白酶体抑制诱导DA能神经元变性的作用就其细胞活性而言,通过MTT法检测,PC 12细胞经12.5μM Lactacystin或5μMMG132诱导24h后,其细胞活性分别降低79.1%和78.6%,两者之间的活性下降情况无统计学意义（p>0.05）。就其形态学而言,通过免疫荧光检测显示,细胞未经蛋白酶体抑制剂诱导前细胞数量多、分别均匀、核大而圆、核浆界限清晰、胞浆浓缩,诱导后细胞数量减少、胞体皱缩变小、结构不清。为了探讨索CDNF对PC12细胞株的神经保护和逆转作用,在细胞进行Lactacystin/MG132诱导前施加200nM的CDNF作用6h,MTT法检测发现细胞活性分别下降至52.3%和49.7%,与实验组相比CDNF的神经保护作用均具有统计学意义（对Lactacystin:p<0.05、对 MG132:p<0.01）;而在细胞进行 Lactacystin/MG132诱导后施加200nM的CDNF作用24h,细胞活性分别下降至59.5%和56.2%,与实验组相比CDNF的神经逆转作用均具有统计学意义（对Lactacystin:p<0.05、对MG132:p<0.01）。其形态学观察发现其无论细胞数量、胞体形态及核浆界面均较未经CDNF处理的要明显改善。就其胞浆中蓄积的alpha-synuclein蛋白检测结果而言,经12.5μM Lactacystin或5μM MG132诱导24h后,其细胞内alpha-synuclein荧光光密度定量检测分别为2.1755和2.8990。在Lactacystin/MG132 诱导前经 200nM 的 CDNF 作用 6h,其表达 alpha-synuclein 的细胞数量减少,其荧光光密度分别下降至1.3871和1.1710,较实验组其光密度值下降具有统计学意义（p<0.05）;而在细胞进行Lactacystin/MG132诱导后施加200nM的CDNF作用24h,其荧光光密度分别下降至1.4899和1.2958,较实验组其光密度值下降具有统计学意义（p<0.05）。研究二、CDNF对蛋白酶体表达以及水解酶活性的调控作用就26s蛋白酶体表达而言,通过MTT法检测,PC 12细胞经12.5μM Lactacystin或5μMMG132诱导24h后,其26s蛋白酶体活性分别,较正常的未处理细胞组具有统计学意义（p<0.05）。为了探讨索CDNF对蛋白酶体表达的作用,在细胞进行Lactacystin/MG132诱导前施加200nM的CDNF作用6h,MTT法检测发现26s蛋白酶体表达明显上调,较实验组具有统计学意义（p<0.05）,而且MG132组较Lactacystin组作用更明显,但无统计学意义（p>0.05）;而在细胞进行Lactacystin/MG132诱导后施加200nM的CDNF作用24h,检测发现MG132组的26s蛋白酶体表达上调明显,较实验组相比具有统计学意义（p<0.05）,而Lactacystin组上调不明显,较实验组相比无统计学意义（p>0.05）。就其蛋白酶体中的三种水解酶而言,实验组的三种水解酶较未处理组而言均下降明显,与未处理组相比具有统计学意义（p<0.05）。为了探讨索CDNF对蛋白酶体中三种水解酶（谷氨酰肽水解酶、糜蛋白酶和胰蛋白酶）表达的作用,在Lactacystin/MG132诱导前后分别加入200nM的CDNF进行干预。检测结果显示CDNF对MG132与Lac诱导的谷氨酰肽水解酶均有保护作用（p<0.05）,而且二者之间的作用程度无统计学差异（p>0.05）;CDNF对谷氨酰肽水解酶均有逆转作用（p<0.05）,且MG132相较Lactacystin而言作用更明显（p<0.05）。CDNF对MG132诱导的PC12细胞糜蛋白酶有保护作用（p<0.05）,而对Lactacystin诱导的糜蛋白酶无保护作用（p>0.05）;CDNF对糜蛋白酶没有逆转作用（p>0.05）,尽管MG132相比Lactacystin而言作用更明显。CDNF对Lactacystin所抑制的胰蛋白酶无保护作用无统计学意义（p>0.05）,而对MG132所作用的胰蛋白酶具有保护作用具有统计学意义（p<0.05）,但是对二种蛋白酶体抑制剂所作用的胰蛋白酶无逆转作用（p>0.05）。结论:1.CDNF对MG132/Lactacystin所诱导的PC12细胞变性具有保护和逆转作用,而且二者之间无统计学差异;2.CDNF对MG132/Lactacystin诱导的26s蛋白酶体具有保护作用,而MG132比Lac保护作用更好;CDNF对MG132作用的26s蛋白酶体具有逆转作用,而对Lac作用的26s蛋白酶体无逆转作用;3.CDNF对MG132/Lacatacystin诱导的谷氨酰肽水解酶均有保护作用,二者之间无统计学差异;CDNF对谷氨酰肽水解酶均有逆转作用,MG132比Lac具有统计学意义;4.CDNF对MG132所抑制的糜蛋白酶有保护作用,而对Lac诱导的糜蛋白酶无保护作用;CDNF对糜蛋白酶没有逆转作用,尽管MG132比Lac逆转作用有统计学意义;5.CDNF对Lactacystin所抑制的胰蛋白酶无保护作用,而对MG132所作用的胰蛋白酶具有保护作用,但是对两种蛋白酶体抑制剂Lactacystin/MG132所作用的胰蛋白酶无逆转作用。