肝纤维化是各种慢性肝病向肝硬化转变的中间环节,由于其病理机制复杂,目前临床上仍缺乏有效防治的方法和药物。近年来研究发现,特异性调控肝星状细胞(HSC)自噬进而阻断HSC活化极有可能成为防治肝纤维化的新策略。千层纸素A是中药黄芩的主要有效成分之一,目前尚无千层纸素A通过调控HSC自噬发挥抗纤维化作用的报道。在前期实验中我们发现,千层纸素A对正常肝细胞没有明显毒性,但能够显著抑制HSC活化标志物α-SMA及提高自噬标志物LC3-Ⅱ表达,也能够明显抑制ROS、IL-1β及mTOR磷酸化的水平。根据以上预实验结果,我们推测:千层纸素A可能通过影响ROS生成调控PI3K-AKT-mTOR通路,促进HSC自噬水平,进而抑制HSC活化和改善炎症微环境,发挥抗肝纤维化作用。本文将围绕这个假说开展实验研究。首先,明确千层纸素A体内外对肝纤维化和炎症微环境的改善作用,为进一步探索其抗肝纤维化机制提供基础。在体内实验中,以腹腔注射CCl4建立肝纤维化小鼠模型并给予千层纸素A;在体外实验中,用PDGF-BB处理原代HSC模拟体内HSC活化过程,再给予千层纸素A干预。体内结果显示:千层纸素A能够明显减轻肝损伤,减少胶原含量和沉积,改善肝纤维化病理特征;能够剂量依赖性降低肝损伤指标AST、ALT、ALP、LDH、GLB/ALB、TBIL及肝纤四项C-Ⅳ、PC-Ⅲ、LN、HA和HYP的水平;能够显著降低HSC活化标志物 α-SMA、αl(I)collagen、Fibronectin、Desmin、TNF-α、PDGF-βR、TGF-β1R 及促炎因子NF-KB、TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-18、IFN-γ、NLRP3、Cleaved-IL-1β、Pro-IL-1β、Pro-IL-18的表达,显著提高抑炎因子IL-10水平,表明千层纸素A体内能够改善CC14致小鼠肝纤维化及炎症微环境。体外结果显示:千层纸素A能够剂量依赖性下调 HSC 活化标志物 α-SMA、Desmin、αl(I)collagen、Fibronectin、TGF-β、TNF-α 及促炎因子 IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18、IFN--γ、TNF-α、NF-κB、NLRP3、Cleaved-IL-1β、Pro-IL-1β、Pro-IL-18的表达,显著上调抑炎因子IL-10表达,表明千层纸素A体外能够抑制HSC活化及炎症因子的生成与释放。由此可见,千层纸素A具有抗纤维化及改善炎症微环境的作用。接下来,从体内外的角度探讨千层纸素A抗纤维化作用与其调控HSC自噬的相关性。体内结果显示:千层纸素A能够剂量依赖性提高自噬标志物LC3-Ⅱ、Atg3、Atg4、Atg5-Atg12、Atg6/Beclin1、Atg7、Atg9、Atg12、Atg14 的表达,显著降低 p62 表达;TEM 结果发现千层纸素A能够促进自噬小体生成及增强自噬流;同时给予纤维化小鼠自噬抑制剂氯喹和千层纸素A进行反向验证,结果发现氯喹能够阻断千层纸素A对自噬的促进作用,进而削弱千层纸素A对肝纤维化标志物及炎症因子的抑制作用,表明体内阻断自噬能够削弱千层纸素A改善肝纤维化及炎症微环境的作用;体外结果显示:千层纸素A以剂量依赖性和时间依赖性的方式提高活化型HSC中LC3-Ⅱ表达;能够剂量依赖性上调Atg3、Atg5-Atg12、Atg6/Beclin1的表达,同时显著降低p62表达;与单独给予千层纸素A干预相比,联合给予自噬抑制剂氯喹和千层纸素A明显提高LC3-Ⅱ表达,表明千层纸素A能够促进HSC自噬流;透射电镜结果也发现千层纸素A能够促进自噬体生成及增强自噬流;此外,同时给予活化型HSC自噬抑制剂3-MA和千层纸素A进行反向验证,结果发现3-MA能够明显降低千层纸素A对LC3-Ⅱ表达的促进作用;明显削弱千层纸素A对HSC活化标志物 α-SMA、α1(Ⅰ)collagen、Desmin、TGF-β、TNF-α、TGF-β1R、PDGF-βR 表达的抑制作用;明显削弱千层纸素A对HSC促炎因子IL-1β、IL-6、IL-8、IFN-γ、TNF-α、NLRP3、NF-κB、Cleaved-IL-1β、Pro-IL-1β表达的抑制作用及对抑炎因子IL-10表达的促进作用,表明体外阻断HSC自噬通路能够削弱千层纸素A对HSC活化及炎症因子生成与释放的抑制作用;综合体内外结果可以发现,千层纸素A通过促进HSC自噬发挥抗纤维化及改善炎症微环境作用。紧接着,阐明千层纸素A通过调控PI3K-AKT-mTOR信号通路促进HSC自噬,进而改善肝纤维化及抑制炎症因子生成与释放的作用机制。结果显示:千层纸素A能够剂量依赖性降低活化型HSC中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR比值。然后我们使用mTOR过表达质粒联合千层纸素A处理活化型HSC进行反向验证,结果发现,mTOR过表达能够明显削弱千层纸素A对p-mTOR/mTOR比值的抑制作用;明显削弱千层纸素A对自噬标志物 LC3-Ⅱ、Atg3、Atg5-Atg12、Atg6/Beclin1、Atg9、Atg12、Atg14 表达的促进作用及对p62表达的抑制作用;明显削弱千层纸素A对HSC活化指标α-SMA、α1(Ⅰ)collagen、Fibronectin、Desmin、TGF-β1R、PDGF-βR表达的抑制作用;明显削弱千层纸素A 对促炎因子 TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6、IL-8、NF-κB、NLRP3、Cleaved-IL-1β、Pro-IL-1β表达的抑制作用及对抑炎因子IL-10表达的促进作用。由此可见,千层纸素A可能通过抑制PI3K-AKT-mTOR信号通路,促进HSC自噬,进而发挥抑制HSC活化及炎症因子生成与释放的作用。最后,阐明千层纸素A通过影响ROS生成调控PI3K-AKT-mTOR信号通路,促进HSC自噬,进而发挥抗肝纤维化及改善炎症微环境的潜在作用靶点及分子机制。结果显示,千层纸素A以剂量依赖性和时间依赖性的方式降低活化型HSC中ROS水平及提高GSH/GSSG比值。此外,我们发现千层纸素A抑制ROS水平可能与其促进HSC自噬水平有关;联合使用自噬抑制剂3-MA和千层纸素A处理活化型HSC,结果发现,3-MA能够明显削弱千层纸素A对ROS生成的抑制作用及对GSH/GSSG比值的促进作用,说明千层纸素A可能通过促进HSC自噬通路进而抑制ROS生成。然后,我们联合使用GSH抑制剂BSO与千层纸素A处理活化型HSC进行反向验证,结果发现,BSO能够明显削弱千层纸素A对ROS生成及对p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR比值的抑制作用,说明千层纸素A通过抑制ROS生成进而阻断PI3K-AKT-mTOR信号通路;BSO能够削弱千层纸素 A 对 HSC 活化标志物 α-SMA、αl(Ⅰ)collagen、Fibronectin、Desmin、TGF-β1R、PDGF-βR表达的抑制作用,说明千层纸素A通过抑制ROS生成进而抑制HSC活化;BSO能够明显削弱千层纸素A对促炎因子TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18、NLRP3、NF-κB、Pro-IL-1β、Cleaved-IL-1β水平的抑制作用及对抑炎因子IL-10水平的促进作用,说明千层纸素A通过抑制ROS生成进而抑制活化型HSC炎症因子的生成与释放。由此可见,千层纸素A可能通过调控ROS-PI3K-AKT-mTOR-自噬回路,抑制HSC活化及炎症因子的生成与释放。综上所述,本文第一次揭示了千层纸素A可能通过调控ROS-PI3K-AKT-mTOR-自噬回路,改善肝纤维化及炎症微环境,这为今后将千层纸素A开发成有潜力的防治肝纤维化药物提供有力的依据。