胰岛素是一种重要的蛋白质激素,其主要用于糖尿病的治疗。目前,胰岛素的给药方式主要为皮下注射给药,但该给药方式易给患者在使用过程中带来不便和不适感。因此,胰岛素的非注射给药方式成为研究热点。其中肺部吸入给药被认为是药物吸收最好的一种非注射给药方式,吸入型胰岛素主要利用真空冷冻干燥的方式制备获得。但对热敏性蛋白药物胰岛素而言,该制备方式易使其失活。因此,迫切需要寻求有效的保护剂,在冻干和储存过程中保护胰岛素活性。本课题的研究内容主要分为以下三部分:首先,利用高效液相色谱(HPLC)测定冻干品中胰岛素效价和差示扫描量热仪(DSC)测定冻干样品玻璃化转变温度等的方法,以研究LEA蛋白特征重复片段(LEA-motif,LEAM)和海藻糖及其二者协同作用对热敏性蛋白药物胰岛素的冻干活性保护效果和热稳定性的影响。HPLC测定结果表明,LEAM或海藻糖均对热敏性蛋白药物胰岛素具有一定冻干活性保护效果,且LEAM的冻干活性保护效果优于海藻糖。两种保护剂复合保护时,少量海藻糖与LEAM共存时,对胰岛素的活性保护具有协同增效的作用。DSC测定结果表明LEAM保护的胰岛素冻干样品的热稳定性高于海藻糖保护的胰岛素冻干样品。两种保护剂协同作用不仅可有效提高冻干样品的玻璃化转变温度,而且提升了冻干样品的玻璃体强度,增加了冻干样品的热稳定性。其次,通过加速试验研究了LEAM保护剂对冻干品在恒温储存过程中的活性保护效果。研究发现胰岛素的降解反应遵从一级反应动力学方程。胰岛素-LEAM冻干品25℃储存时的活性成分损失10%和50%所需时间比相同条件下储存的胰岛素冻干品分别延长6.73天和44.22天;而胰岛素-LEAM冻干品4℃储存时的胰岛素活性成分损失10%和50%所需时间比相同条件下储存的胰岛素冻干品分别延长228.11天和1499.12天。因此,LEAM能够在储存过程中有效保护胰岛素冻干品的活性。最后,利用Gromacs软件和Gromos96(53a6)简化分子力场,选用REMD分子模拟方法,研究了蔗糖对胰岛素的干燥活性保护效果和机理。通过研究发现:与原始结构相比,添加蔗糖保护剂干燥后的胰岛素,在整体三维结构、均方根偏差(RMSD)、二级结构方面改变较小,且能稳定胰岛素蛋白及其主链上形成的氢键。证明蔗糖是胰岛素的一种优良干燥保护剂,且蔗糖与胰岛素之间的氢键相互作用是使蔗糖具有干燥保护作用的主要因素。综上所述,通过实验研究,揭示了真空冻干过程中LEA蛋白特征重复片段与海藻糖对胰岛素的协同冻干保护效果,同时研究表明,LEA蛋白特征重复片段在储存过程中也能够持续地保护胰岛素的生物活性。通过理论研究,我们发现蔗糖也是一种潜在的优良干燥保护剂,因为其在干燥过程中,也可以有效保护胰岛素的生物活性。因此,该课题的研究对未来胰岛素新剂型的开发具有指导意义,为基于分子模拟方法的热敏性蛋白药物冻干保护剂的处方研究提供了一定理论依据。