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第一部分p120活化NF-κB信号通路在香烟烟雾诱导的气道上皮细胞炎症反应中的作用一、目的通过香烟烟雾提取物(CSE)刺激人气道上皮细胞建立气道炎症反应的体外模型,检测连环素p120(p120)表达变化及其对NF-κB信号通路的影响,初步探讨香烟烟雾所致气道炎症的分子机制。二、方法根据本实验室经验及相关文献制备100%CSE溶液,采用MTT检测不同浓度CSE(1%,5%,10%,15%,20%,30%,40%,50%)对细胞活力的影响。根据MTT结果,选用15%CSE作用不同时间,采用Western blot检测p120、IκBα及p-IκBa蛋白的表达变化,并采用Real-time PCR检测p120mRNA水平；运用免疫荧光、核浆分离提取蛋白技术检测NF-κB p65蛋白表达及分布的改变；采用ELISA和Real-time PCR检测IL-8蛋白及mRNA表达水平的改变。采用瞬时转染特异性p120siRNA敲低上皮细胞中p120的表达或采用脂质体瞬时转染p1201A和3A质粒,观察CSE刺激下p120表达水平变化对NF-κB信号通路的影响。三、结果1.MTT结果显示15%CSE刺激24h后气道上皮细胞仍保持80%的活力,但20%CSE作用后细胞活力降至40%。Western blot检测发现p120主要以亚型3存在于人气道上皮细胞,其表达下调呈浓度和时间依赖性。Real-time PCR结果显示p120mRNA含量也一致性减少。2.15%CSE刺激人气道上皮细胞后,Western blot检测显示IκBα表达减少而p-IκBα水平增加；细胞核浆分离提蛋白后Western blot检测发现NF-κB p65蛋白胞质表达减少,而核内表达增加；免疫荧光染色也证实NF-κB p65发生核转位。同时,Real-time PCR和ELISA检测发现前炎症因子IL-8(NF-κB信号下游的靶基因)蛋白及mRNA的表达随刺激时间的延长显著增加。3.采用siRNA沉默p120在气道上皮细胞中的表达后给予15%CSE刺激,虽然NF-κB总蛋白含量没有变化,但其在Ser536位点的磷酸化显著增加,与Scramble组比较,差异具有显著性(P<0.05)。ELISA检测发现IL-8、IL-1β及IL-6的表达水平较Scramble组也显著增加(P<0.001)。4.转染p1201A和3A质粒入气道上皮细胞后给予15%CSE刺激,虽然NF-κB总蛋白没有改变,但其在Ser536位点的磷酸化相对于MT组显著降低,差异具有显著性(P<0.05)。同时,ELISA检测发现IL-8、IL-1p及IL-6的表达水平较MT组显著减少(P<0.001)。四、结论在CSE诱导的气道炎症反应中,p120可能通过NF-κB信号通路发挥调控炎症反应的作用。第二部分气道炎症反应中p120活化NF-κB信号通路的可能机制一、目的通过检测CSE刺激后RhoA/ROCK的活性和蛋白水平变化以及另一种粘附连接蛋白E-cadherin的表达变化,进一步探讨气道炎症反应中p120活化NF-κB信号通路的可能分子机制。二、方法首先采用CSE刺激复制气道上皮细胞炎症反应模型,然后加入ROCK抑制剂Y27632抑制RhoA/ROCK信号,瞬时转染特异性p120siRNA沉默p120或p1203A质粒外源性过表达p120,并转染不能结合RhoA的p120突变质粒(p120DRDD-GFP)及不能结合E-cadherin的p120突变质粒(p120DEcad-GFP),采用Western blot检测p120、 E-cadherin、 NF-κB p65、 RhoA及ROCK1的蛋白表达；免疫共沉淀技术检测p120与RhoA结合情况；免疫荧光和ELISA技术检测NF-κB p65的定位和Ser536位点的磷酸化情况；G-LISA技术检测RhoA活性的变化。三、结果1.15%CSE刺激后,Western blot结果显示虽然RhoA总蛋白没有变化,但是下游蛋白ROCK1的表达增加：粘附连接蛋白E-cadherin的表达减少。2.免疫共沉淀结果发现气道上皮细胞中p120与RhoA存在于同一复合物中。15%CSE作用下,虽然与p120结合的RhoA蛋白改变不明显,但G-LISA检测显示RhoA活性显著上升。3. siRNA沉默p120后,在15%CSE刺激后气道上皮细胞内虽然RhoA,总蛋白无变化,但ROCK1的表达增加。G-LISA检测也显示RhoA的活性显著上升,与Scramble组比较,差异显著(P<0.05)。过表达p1203A后,在15%CSE刺激后气道上皮细胞内的RhoA和ROCK1的表达都减少。G-LISA检测也显示,相对于MT组RhoA活性显著降低。4.采用Y27632抑制RhoA/RCOK1信号通路后,免疫荧光发现NF-κB p65的入核被部分抑制；ELISA技术检测发现NF-κB p65(Ser536)的磷酸化也减少。5.转染p120DRDD-GFP质粒后,发现即使在15%CSE刺激下,RhoA和ROCK1的表达都无明显变化；NF-κB p65(Ser536)的磷酸化和RhoA活性也没有变化。而转染p120DEcad-GFP质粒后,虽然NF-κB p65的表达没有变化,但RhoA的表达减少,NF-κB p65(Ser536)的磷酸化减少,RhoA舌性也降低。四、结论1.人气道上皮中,p120可以与RhoA结合,CSE刺激可以激活RhoA/ROCK信号。2.沉默p120可增强CSE诱导的RhoA/ROCK信号的活化,而过表达p1203A可部分抑制CSE诱导的RhoA/ROCK信号的激活。3.抑制剂Y27632抑制RhoA/ROCK信号通路后,CSE诱导的NF-κB活化被部分抑制。4.p120不能与RhoA结合后,不能活化NF-κB信号通路；而不能与E-cadherin结合后,活化NF-κB信号通路不受影响。由此可见,气道炎症反应中p120可能通过RhoA/ROCK活化NF-κB信号通路,而且不依赖E-cadherin。