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目的:本研究的主要目的是探索小檗碱对EGFR-TKI治疗NSCLC时的增敏作用以及相关分子机制,以期为小檗碱潜在的抑癌作用提供更充分的理论依据,并有望对进一步提高靶向治疗的效果,为临床EGFR-TKI的联合用药提供新的方法和实验证据。方法:体外实验第一部分:1.采用MTT法和BrdU掺入法检测不同剂量小檗碱在不同的时间对EGFR-TKI不敏感的A549细胞和对EGFR-TKI突变耐药的H1975细胞增殖的影响;同时采用流式细胞术检测不同剂量BBR处理后各细胞周期的变化,以确认小檗碱对细胞增殖的抑制作用。2.采用MTT法检测小檗碱联合吉非替尼对A549和H1975细胞增殖的影响,并使用CompuSyn软件计算两药的联合用药指数,分析联合用药的效果,确认最佳联合用药剂量。同时,采用EdU染色法检测小檗碱联合吉非替尼对两细胞增殖的影响。3.采用Western blot法检测不同剂量小檗碱以及小檗碱联合吉非替尼对A549和H1975细胞内PDPK1,Sp1,DNMT1蛋白表达的影响;同时还使用Real-time PCR检测小檗碱对细胞内DNMT1 mRNA表达的影响;使用双荧光素酶报告基因系统检测小檗碱对细胞内DNMT1启动子活性的影响。4.为了检测小檗碱对PDPK1,Sp1,DNMT1三者之间关系的影响,分别体外瞬时转染三者的过表达质粒:pCMV6-PDPK1,pcDNA3.1-Sp1,pCMV6-DNMT1,然后BBR处理后,Western blot法检测各处理组细胞内过表达相应蛋白后对另两个蛋白表达的影响,进而确定三个蛋白之间的相互作用关系。5.在A549和H1975细胞内过表达DNMT1后,MTT法检测BBR对细胞增殖的影响,以明确DNMT1在BBR介导的NSCLC细胞增殖抑制过程中的作用。体外实验第二部分:1.采用Transwell实验和细胞划痕实验分别检测小檗碱及其联合吉非替尼对A549和H1975细胞侵袭和转移能力的影响。2.采用Western blot法检测不同剂量小檗碱以及小檗碱联合吉非替尼对A549和H1975内EMT相关标记物:E-cadherin,Vimentin,Snail蛋白表达的影响。3.采用Real-Time PCR检测小檗碱及其联合吉非替尼对A549和H1975细胞内LncRNA HOTAIR 和 miR-34a-5p 表达的影响。4.采用HOTAIR siRNA沉默A549和H1975细胞内LncRNA HOTAIR的表达;另外,使用pcDNA3.1-HOTAIR过表达质粒瞬时转染A549和H1975细胞,BBR处理;再使用Western blot法检测肺癌细胞内E-cadherin和Snail蛋白表达,Real-Time PCR检测miR-34a-5p的表达情况。以明确LncRNA HOTAIR对EMT相关基因和miR-34a-5p表达的影响。5.转染 mimic,过表达 A549 和 H1975 细胞内 miR-34a-5p,Real-Time PCR 检测肺癌细胞内LncRNA HOTAIR的表达,Western blot法检测Snail蛋白的表达。另外,分别检测转染含双荧光素酶报告基因的HOTAIR-Wt和Mut,Snail 3’ UTR-Wt和Mut质粒后,过表达细胞内miR-34a-5p对细胞荧光素酶活性的影响。以确认miR-34a-5p与LncRNA HOTAIR和Snail之间是否存在靶向调控的关系。6.采用pEZ-MO2-Snail过表达质粒转染A549和H1975细胞,BBR处理后,再使用Western blot法检测肺癌细胞内E-cadherin蛋白的表达,双荧光素酶报告基因系统检测E-cadherin启动子的活性。以明确EMT关键转录因子Snail对EMT标记物E-cadherin表达的调控方式。体内动物实验:1.采用裸小鼠建立体表荷瘤小鼠模型,使用小檗碱联合吉非替尼给药处理。观察小鼠一般情况,采用小动物活体成像仪检测各组小鼠体表肿瘤给药前和给药后荧光值的变化,测量小鼠体表肿瘤体积,并在小鼠处死后剥离体表肿瘤称重,以检测各药物处理对小鼠体表肿瘤生长的影响。2.采用尾静脉注射肿瘤细胞建立肺转移模型小鼠,使用小檗碱联合吉非替尼给药处理。观察小鼠一般情况,采用小动物活体成像仪检测各组小鼠肺部肿瘤的生长,处死小鼠后,肺灌注,观察各小鼠肺部转移瘤生长情况,并取出肺脏,多聚甲醛固定后石蜡包埋,HE染色观察各组小鼠肺部病变状态。3.Western blot法和Real-Time PCR分别检测各组小鼠肿瘤组织内细胞增殖相关基因和EMT相关基因的表达。结果:体外实验第一部分:小檗碱联合吉非替尼抑制NSCLC细胞增殖及相关分子机制1.小檗碱可呈时间、剂量依赖关系抑制A549和H1975细胞的增殖;且其联合吉非替尼抑制肺癌细胞的生长具有协同作用,联合给药组对A549和H1975细胞增殖的抑制作用明显优于小檗碱和吉非替尼单独处理组。2.小檗碱可呈一定剂量依赖关系抑制A549和H1975细胞内PDPK1,Sp1,DNMT1蛋白的表达;且其联合吉非替尼给药组对这些蛋白表达的抑制作用明显优于两药单独处理组。另外,小檗碱还能抑制A549和H1975细胞内DNMT1启动子的活性和mRNA的表达。3.在A549和H1975细胞内,无论过表达Sp1还是PDPK1均能逆转小檗碱对DNMT1和彼此蛋白表达的抑制作用,且过表达PDPK1还能阻断小檗碱对DNMT1启动子活性的抑制。4.过表达A549和H1975细胞内DNMT1的表达可以逆转小檗碱对A549和H1975细胞增殖的抑制作用,但对细胞内Sp1和PDPK1蛋白的表达无显著影响。体外实验第二部分:小檗碱联合吉非替尼抑制NSCLC细胞EMT过程发生及相关分子机制1.小檗碱及其联合吉非替尼可协同抑制A549和H1975细胞的侵袭和转移能力;且联合给药组的抑制作用最佳。2.小檗碱能上调A549和H1975细胞内E-cadherin,下调Vimentin和Snai l蛋白的表达;其联合吉非替尼处理后,联合给药组对E-cadherin蛋白的上调作用和对Snail蛋白的抑制作用明显优于两药单独处理组。3.在A549和H1975细胞内,小檗碱联合吉非替尼能协同抑制LncRNA HOTAIR的表达,诱导miR-34a-5p的表达;且联合给药组对LncRNA HOTAIR的抑制作用和对miR-34a-5p的诱导作用明显优于两药单独处理组。4.沉默HOTAIR能上调A549和H1975细胞内E-cadherin的表达,下调Snail和miR-34a-5p的表达;而过表达A549和H1975细胞内HOTAIR,能逆转小檗碱对E-cadherin的诱导作用和对Snail、miR-34a-5p的抑制作用。5.过表达miR-34a-5p明显抑制转染HOTAIR-Wt质粒后细胞的荧光素酶活性。且过表达miR-34a-5p能下调转染Snail 3’ UTR-Wt质粒后细胞的荧光素酶活性,抑制A549和H1975细胞内Snail的表达。6.过表达Snail能逆转小檗碱对A549和H1975细胞内E-cadherin启动子活性和蛋白表达的抑制作用。体内动物实验:1.小檗碱联合吉非替尼可显著抑制荷瘤小鼠体表肿瘤的生长;且给药处理终点,联合给药组体表肿瘤的重量以及肿瘤荧光值均为各组最小值,且与吉非替尼单独给药组有显著统计学意义的差异。2.小檗碱联合吉非替尼可显著抑制体内肺部转移瘤的生长,各给药组肺部肿瘤的生长个数明显少于对照组,且联合给药组最少。3.相对对照组,各药物处理组肿瘤组织内PDPK1,Sp1,DNMT1蛋白的表达明显较少,且联合给药组最明显;另外,相对对照组,各药物处理组肿瘤组织内E-cadherin和miR-34a-5p的表达增加,LncRNA HOTAIR和Snail的表达减少,且且联合给药组变化最明显。结论:1.小檗碱联合吉非替尼可以通过PDPK1/Sp1/DNMT1信号通路协同抑制NSCLC细胞的增殖。2.小檗碱联合吉非替尼可以通过LncRNA HOTAIR/miR-34a-5p/Snail信号通路协同抑制NSCLC细胞的EMT过程发生。3.在体内动物实验中,小檗碱联合吉非替尼可显著抑制荷瘤小鼠体表肿瘤和体内肺部转移瘤的生长;且体外实验相关基因的表达情况也能在小鼠肿瘤组织中得到相应的结果验证。