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随着我国社会主义市场经济的高速发展，性传播性疾病(sexually transmitted disease，STD)的发病率有逐年增长的趋势。尖锐湿疣(condyloma acuminata，CA)是皮肤科临床工作中常见的一种性传播性疾病，现有治疗方法的疗效不能令人满意。研究表明局部抗人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)的细胞免疫功能低下是CA持续、难治的重要机制之一。因此，提高患处局部细胞免疫功能可更有效地治疗CA。 已有研究证明HPV肽段(如HPV16 E6、E7)能激发有效的细胞免疫反应而产生抗病毒、抗肿瘤作用。研制HPV肽段疫苗因而成为当前人们研究如何攻克CA的热点。但是，鲜有研究是针对HPV6或11型的。而HPV6，11型正是人类CA的主要病原体。为了寻找更理想的CA防治手段，本文通过分子生物学方法进行了研制HPV6b亚型E7肽段疫苗的最初一部分实验，即以HPV6b基因组为模板克隆、原核表达了HPV6b E7基因，大量获得了GST-HPV6b E7融合蛋白。GST-HPV6b E7融合蛋白的获得将为HPV6b E7蛋白的免疫学功能研究、HPV6b E7肽段疫苗的研制提供了理论依据。 方法 1、PCR扩增与T-A克隆(亚克隆)：以质粒pUC19/HPV6b genome为模板设计一对引物(含EcoR Ⅰ，Xho Ⅰ限制性酶切位点)，行PCR扩增反应产生HPV6b E7 DNA。回收纯化PCR产物，连接到质粒pGEM-T，构建成浙江大学医学院 硕土学位论文亚克隆质粒PGEMJ／HPV6b E7。酶切并测序鉴定亚克隆质粒。 2、原核表达载体的构建：分别回收、纯化经双酶切切下的HPV6b E7DNA和原核表达载体PGEX叶T七片段。回收产物连接构建成原核表达载体PGEX－4T－2／HPV6b E7。酶切并狈序鉴定原核表达载体。 3、GST十PV6b E7融合蛋白的诱导表达：挑取含原核表达载体PGEX－4T－2／HPV6b E7的单菌落接种LB培养液，摇床培养过夜。次日按一定比例将菌液接种于新鲜LB培养液，摇床上继续培养，加入IPTG，合适温度下继续诱导培养（诱导温度，培养时间等视实验结果而调整）。收集细菌并行超声波粉碎菌体，离心分离上清和沉淀。10％SDS干AGE电泳分析蛋白表达结果。 唾、踞卜m仍b阶融合蛋白的可溶性分析和纯化：m贴0于N哑电泳分析GST－HPV6b E7融合蛋白的可溶性。亲和层析法纯化GST－HPV6b E7融合蛋白。用Folin－酚法定量测定纯化的GST－HPV6b E7融合蛋白浓度。 结 果 成功构建了含HPV6b E7 DNA的亚克隆质粒和原核表达载体。酶切及测序鉴定表明：亚克隆质粒和原核表达载体多克隆位点两端连接处及插入片段序列正确。经诱导表达和超声破碎，10％SDS－PAGE电泳分析发现分子量约37kDa的新增浓染条带，即为GST－HPV6b E7融合蛋白（GST蛋白分子量约 26kDa，理论上计算 HPV6b E7蛋白分子量约 llkDa）；并且 GST－HPV6bE7 融合蛋白主要存在于可溶相之中。用亲和层析法纯化回收得到GST－HPV6b E7融合蛋白，测定纯化的 GST－HPV6b E7融合蛋白浓度为6．6mg／ml，计算每升诱导菌可获约 8．4mg GST－HPV6b E7融合蛋白。 结 论 1．成功构建亚克隆质粒PGEM－T／HPV6b E7。 2．成功构建原核表达载体 PGEX－4T－2／HPV6b E7。 4浙江大学医学院 硕士学位论文 3．大量表达和纯化了GST－HPV6b E7融合蛋白。 4．初步摸索并建立了大量制备GST－HPV6b E7融合蛋白的一套实验方法，为进一步研究GST0PV6b E7融合蛋白的免疫学功能、大量生产GST－HPV6b E7融合蛋白以及制备HPV6b E7肽段疫苗打下了基础。