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乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,三阴性乳腺癌(Triple NegativeBreast Cancer,TNBC)是指免疫组化标记雌激素受体、孕激素受体和人表皮生长因子受体2均为阴性的一类,其恶性度高、异质性强、缺乏有效治疗手段,是乳腺癌中预后最差的亚型,亟待深入研究分子生物学和肿瘤生物学特征。基因组不稳定性是肿瘤的主要特征之一。基因组不稳定有利于肿瘤细胞变异演变、增加多样性、在选择压力下得以存活,是肿瘤发生发展的重要驱动力。本实验室前期研究发现,在化疗药物处理的选择压力下,p53突变型的三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231的基因组不稳定性显著高于p53野生型的ERα阳性细胞,但其产生的机制尚不清楚。长散布元件(Long Interspersed Element-1,LINE-1)是一种在人类基因组中广泛存在的逆转录转座子,编码两个蛋白产物,ORF1和ORF2,其中ORF2兼有核酸内切酶和逆转录酶活性。LINE-1在正常体细胞中处于被高度抑制状态,而在肿瘤细胞中,应其启动子区甲基化水平下降和其他表观修饰的变化,LINE-1会被不同程度地激活。LINE-1基因产物可将自身序列或Alu序列等插入到基因组的其他位置,改变基因表达和基因组结构。此外,ORF2引发的DNA断裂本身也是造成基因组不稳定的重要因素。研究显示,LINE-1的异常表达可促进多种肿瘤的恶性进展。已知压力刺激是LINE-1激活的重要诱因,但化疗药物对三阴性乳腺癌中LINE-1基因活性及LINE-1介导的基因组不稳定性的后期效应尚待探讨。鉴于基因组不稳定改变了细胞已建立的基因组结构和基因表达模式,对细胞具有破坏性,耐受LINE-1异常表达导致的基因组不稳定,是肿瘤细胞获得进一步演变能力的必要前提。探究三阴性乳腺癌为何能够耐受基因组不稳定进而获得大量遗传变异,将为突破目前对三阴性乳腺癌的认识及治疗瓶颈提供十分有价值的线索。p53在维持细胞基因组稳定中发挥关键作用,在DNA损伤过于严重时触发凋亡从而清除受损细胞。p53基因在高达80%的三阴性乳腺癌中发生突变失去其正常功能。此外,在p53突变型肿瘤中LINE-1的表达更高,提示丧失p53蛋白功能是肿瘤细胞能够耐受LINE-1介导的基因组不稳定的重要前提。本课题旨在运用基因分析、彗星、免疫荧光、流式等分子生物学和细胞生物学研究方法,探讨化疗药物处理、LINE-1介导的基因组不稳定性和p53三者功能联系及其细胞生物学效应。研究结果显示,化疗药物显著增加p53突变型三阴性乳腺癌细胞基因组不稳定性;提高乳腺癌细胞中LINE-1的表达水平;药物诱导的LINE-1异常表达促进三阴性乳腺癌细胞基因组不稳定性;p53功能缺失是乳腺癌细胞耐受LINE-1介导的基因组不稳定的重要前提,表达野生型p53可显著抑制基因组不稳定细胞的富集:LINE-1异常表达增强MDA-MB-231乳腺癌细胞侵袭迁移能力和化疗耐受性,运用LINE-1抑制剂可逆转LINE-1稳转细胞的侵袭迁移能力和化疗耐受性。本研究为认识三阴性乳腺癌高度异质性的形成机制和改善化疗耐受提供了新的思路和线索。乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,其发病率呈逐年上升的趋势。乳腺癌的发病机制目前尚未完全明了,但抑癌基因的失活或表达下降是其发生的重要机制。ATM是乳腺癌的重要抑癌基因之一,研究证实,ATM基因表达水平下降导致的功能缺失是乳腺癌发生的重要原因,但抑制其表达的机制尚待探索。LINE-1是一种在人类基因组中广泛存在的逆转录转座子,可以存在于基因间,也可以存在于基因内。LINE-1的5’UTR区含有双向启动子,正义启动子起始自身RNA转录,反义启动子(ASP)则可以向相反方向启动邻近基因组序列转录出反义RNA。已知,反义RNA可以以多种方式促进或抑制正义链基因表达水平,其中改变染色质修饰是反义RNA调节正义链基因表达的重要方式之一。ATM基因位于人类染色体的11q22-q23,全长约150kb,共63个外显子。借助生物信息学工具我们对ATM基因序列进行了分析,发现在ATM倒数第二个内含子包含一个全长LINE-1。本课题的目的是探讨该LINE-1的反义启动子(L1-ASP)能否启动反义RNA的转录,该反义转录本是否能够调及如何调控ATM基因的表达。Real time PCR分析结果显示,ATM基因内存在由L1-ASP启动的反义转录本(命名为L1-ATM-AS),且其表达水平在乳腺癌细胞系中显著低于正常乳腺上皮细胞,与细胞的ATM表达水平呈正相关;对65对乳腺癌组织和癌旁组织的分析结果与我们在细胞系中的观察结果一致,乳腺癌组织中L1-ATM-AS与ATM表达水平均显著低于癌旁组织。L1-ATM-AS对ATM基因表达的上调功能有可能通过改变启动子染色质构象来实现,因为我们染色质免疫共沉淀分析结果显示,L1-ATM-AS可以改变ATM启动子区组蛋白修饰,使其处于开放活性状态。进一步研究发现,在正常细胞中干扰L1-ATM-AS表达可抑制ATM介导的DNA损伤修复能力。我们的研究结果表明,ATM基因内LINE-1反义启动子驱动的反义转录本L1-ATM-AS是ATM基因活性的正调控因子,是ATM发挥抑癌功能的重要保证。L1-ATM-AS反义转录本的表达水平异常降低是导致乳腺癌细胞中ATM表达水平下降抑癌功能丧失的重要机制。我们的研究揭示了 ATM抑癌基因表达调控的新机制,同时也进一步证明,基因组中重要重复序列LINE-1能够以非转座子依赖性的方式促进乳腺癌的发生,为认识乳腺癌的发生机制和探索有效治疗策略提供了全新的思路。