大肠癌包括结肠癌和直肠癌,是最常见的消化道恶性肿瘤之一。在西方国家它是癌症引发死亡的“第三大杀手”,在我国大肠癌的发病率居各种消化道肿瘤的第2位,且发病率呈逐年上升趋势。大肠癌病理分型包括腺癌、鳞癌、未分化癌等,其中腺癌最多见,占95%左右。近年来,尽管手术、放疗、化疗、分子靶向治疗等综合治疗使大肠癌的术后生存得到了很大的改善,但是疗效并不乐观。大肠癌的预后与早期诊断、及时正确治疗直接相关。据统计,早期大肠癌的5年生存率高达92%,然而大部分患者就诊时已属于中晚期,失去了根治性手术的机会,因此,大肠癌的早期诊断就更显其突出地位。大量研究表明,肿瘤的发生、发展与细胞增殖和凋亡之间的失衡有关,是多基因参与的过程。细胞凋亡调节异常是肿瘤发生和发展的重要机制之一。其中,原癌基因的激活或抑癌基因的失活促进了细胞的恶性转化,使其出现异常增殖或凋亡抑制,从而促进肿瘤的发生。随着对大肠癌与细胞凋亡的相关机制的研究不断深入,利用大肠癌中细胞凋亡机制进行细胞凋亡诱导来治疗大肠癌已成为一个新的研究方向。目前已发现很多基因与大肠癌的发生、发展有关,如bcl-2基因家族、RAS基因家族、ERBB基因家族、MYC基因家族、p53等。bcl-2相关蛋白X ( bcl-2-associated protein X, Bax )基因是bcl-2基因家族中的重要成员,具有促进细胞凋亡的作用。Bax促进细胞凋亡的主要机制是诱导细胞色素C从线粒体释放至细胞浆,与凋亡蛋白酶活化因子(Apaf-1)结合,然后激活半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-9(Cysteinyl Aspartate Specific Protease-9, Caspase-9)从而启动凋亡级联反应,导致细胞凋亡。Caspase-9是近年发现的Caspase家族成员之一,属于上游起始Caspase,主要在内源性细胞凋亡途径中活化从而激活效应分子Caspase-3而导致细胞凋亡。DNA裂解因子(DNA fragmentation factor,DFF)也被称为Caspase激活DNA酶(CAD),是由分子量分别为45kD和40kD两个亚单位组成的异源二聚体,被命名为DFF45(ICAD)和DFF40(CAD),Caspase-3在细胞凋亡信号启动的Caspase级联活化过程中作为下游Caspase的底物被活化而裂解DFF45,释放出DFF40,并使DFF40形成脱氧核糖核酸酶(DNase),该酶可引起DNA裂解和染色质凝聚,进而产生凋亡小体,引起细胞凋亡。目前有关Bax、Caspase-9和DFF45在大肠腺癌中的研究报道并不多见。本研究旨在检测大肠腺癌手术病理及新鲜癌组织、淋巴结及正常大肠组织标本中Bax、Caspase-9和DFF45蛋白的表达情况,试图探讨三者之间的内在联系,及其在大肠癌发生、发展过程中的作用,从而为临床上大肠癌的早期诊断、治疗及预后判断提供一些实验依据。目的:检测大肠腺癌癌组织、淋巴结和正常大肠组织标本中Bax、Caspase-9和DFF45蛋白的表达情况,分析三种蛋白表达与大肠癌的临床及病理学指标之间的关系,及其三种蛋白之间的相关性分析,初步探讨其在大肠腺癌发生、发展中的作用及临床意义。方法:1.收集2008年6月至2010年4月河北联合大学附院病理科经手术切除后病理确诊的大肠腺癌的存档蜡块62例,其中伴淋巴结转移者20例。采用免疫组织化学SP法检测腺癌组织、淋巴结及正常大肠组织中Bax、Caspase-9和DFF45蛋白的定位及分布情况。分析三种蛋白的表达与临床及病理学指标之间的关系,并分析三种蛋白在20例有淋巴结转移病例原发肿瘤病灶和淋巴结转移病灶中的表达情况,并对Bax、Caspase-9和DFF45三种蛋白的表达进行相关性分析。2.另收集2010年1月至2010年7月河北联合大学附院病理科手术切除的21例大肠腺癌患者的癌组织和正常大肠组织(距肿瘤组织>5cm)新鲜标本,采用Western-blot免疫印记法检测癌组织及正常组织中Bax、Caspase-9和DFF45蛋白半定量表达情况,分析三种蛋白的表达与大肠腺癌分化程度的关系。结果:1.免疫组化检测结果显示Bax、Caspase-9和DFF45蛋白在正常大肠组织及大肠腺癌组织中都有表达。Bax蛋白表达部位主要位于细胞浆,表现为细胞浆出现棕黄色颗粒,呈灶性或弥漫性分布,强弱不等。Bax蛋白在大肠腺癌和正常大肠组织表达的阳性率分别为45.16%(28/62)和72.58%(45/62)。Caspase-9蛋白在细胞浆及部分胞核呈阳性表达,表现为棕黄色颗粒,呈弥漫性或灶性分布。Caspase-9蛋白在大肠癌和正常大肠组织表达的阳性率分别为41.94%(26/62)和77.42%(48/62)。DFF45蛋白主要表达于细胞核,呈清晰棕色,在大肠癌和正常大肠组织表达的阳性率分别为43.55%(27/62)和74.19%(46/62)。Bax、Caspase-9和DFF45蛋白在大肠腺癌组织的表达阳性率均明显低于正常大肠组织,差异均具有显著统计学意义(P<0.01)。2. Western-blot免疫印迹结果显示正常大肠组织及大肠腺癌组织均能检测到Bax、Caspase-9和DFF45蛋白的表达。Bax、Caspase-9和DFF45蛋白在正常大肠组织分别为0.394±0.062、0.323±0.060和0.256±0.056 ,而在大肠腺癌组织的相对半定量表达值分别为0.218±0.045、0.156±0.030和0.110±0.032,三种蛋白在大肠腺癌组织的表达均明显低于正常大肠组织,差异均具有统计学意义(P<0.05)。3. Western-blot免疫印迹结果显示,21例大肠腺癌患者中低分化者5例,中分化者7例,高分化者9例。Bax、Caspase-9和DFF45蛋白在大肠腺癌高分化癌组织的相对半定量表达值分别为0.278±0.050、0.183±0.052和0.133±0.035,而在中低分化癌组织分别为0.110±0.071、0.131±0.046和0.072±0.024,三种蛋白的半定量表达与肿瘤的分化程有关,中低分化者表达低于高分化者,差异均具有统计学意义(P<0.05)。4. Bax、Caspase-9和DFF45蛋白的表达与临床及病理学指标之间的关系分析结果显示,三种蛋白的表达与患者的年龄、性别、肿瘤大小及肿瘤浸润深度均无关(P>0.05),与肿瘤的分化程度、Dukes’分期及淋巴结转移有关。Bax、Caspase-9和DFF45蛋白的表达随着分化程度的降低均降低,中低分化者的表达均低于高分化者(P<0.05);Dukes’C期和D期标本的表达低于A期和B期(P<0.05);有淋巴结转移者阳性表达显著低于无淋巴结转移者(P<0.05)。5.免疫组化检测结果显示,20例有淋巴结转移的大肠腺癌患者中,Bax、Caspase-9及DFF45蛋白在大肠原发病灶组织表达的阳性率分别为30.00%(6/20)、25.00%(5/20)和15.00%(3/20),而在淋巴结转移病灶组织中的表达分别为5.00%(1/20)、0.00%(0/20)和0.00%(0/20)。Bax、Caspase-9及DFF45蛋白在大肠原发病灶组织中的表达阳性率明显高于淋巴结转移病灶组织,差异均具有统计学意义(P P<0.05)。6.免疫组化检测结果显示62例大肠腺癌组织中,Bax蛋白和Caspase-9蛋白双阳性者16例(25.81%),双阴性者24例(38.71%),Bax蛋白阳性而Caspase-9阴性者12例(19.35%),Bax蛋白阴性而Caspase-9阳性者10例(16.13%)。Bax蛋白和Caspase-9蛋白在大肠腺癌组织中的表达呈正相关(P=0.028, r=0.280)。Caspase-9和DFF45蛋白双阳性者16例(25.81%),双阴性者25例(40.32%),Caspase-9蛋白阳性而DFF45阴性者10例(16.13%),Caspase-9蛋白阴性而DFF45阳性者11例(17.74%)。Caspase-9蛋白和DFF45蛋白在大肠腺癌组织中的表达呈正相关(P=0.015, r=0.308)。Bax和DFF45蛋白双阳性者17例(25.81%),双阴性者24例(38.71%),Bax蛋白阳性而DFF45阴性者11例(17.74%),Bax蛋白阴性而DFF45阳性者10例(16.13%)。Bax蛋白和DFF45蛋白在大肠腺癌组织中的表达呈正相关(P=0.013, r=0.314)结论:1. Bax、Caspase-9和DFF45蛋白在大肠腺癌组织及正常大肠组织中均有表达;三种蛋白在癌组织中的表达均低于正常大肠组织;Bax、Caspase-9和DFF45蛋白表达降低,从而细胞凋亡受到抑制,促进了大肠腺癌的发生、发展,提示三者可作为肿瘤细胞增殖和凋亡失衡的生物学指标之一。2. Bax、Caspase-9和DFF45蛋白在大肠腺癌中的表达与年龄、性别、原发肿瘤大小及肿瘤浸润深度无关;而与分化程度、Dukes’分期及淋巴结是否转移有关。Bax、Caspase- 9和DFF45蛋白的低表达,可能促进了大肠腺癌细胞的生长和淋巴结的转移。3. Bax、Caspase-9和DFF45蛋白在淋巴结转移病灶中的表达低于大肠原发肿瘤病灶,提示肿瘤在转移的病灶中出现异质性,凋亡受抑制更为明显,恶性程度增加。4. Bax、Caspase-9和DFF45蛋白在大肠腺癌组织中共同表达,并且Bax与Caspase-9表达、Caspase- 9与DFF45以及Bax与DFF45表达均成正相关,提示Bax可能通过激活Caspase-9发挥促细胞凋亡的作用,而DFF45则作为下游Caspase的底物被活化,三者共同作用,抑制肿瘤的发生。